Evaluación toxicológica de Phormidium sp.  Nanopartículas derivadas de óxido de cobre para sus aplicaciones biomédicas y ambientales.

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Jul 26, 2023

Evaluación toxicológica de Phormidium sp. Nanopartículas derivadas de óxido de cobre para sus aplicaciones biomédicas y ambientales.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 6246 (2023) Cite este artículo 969 Accesos 2 Citas 1 Detalles de Altmetric Metrics Impulsado por la necesidad de biosintetizar agentes biomédicos alternativos para

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 6246 (2023) Citar este artículo

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Impulsadas por la necesidad de biosintetizar agentes biomédicos alternativos para prevenir y tratar infecciones, las nanopartículas de óxido de cobre (CuONP) han surgido como una vía prometedora. La síntesis de CuONP derivada de cianobacterias es de gran interés ya que ofrece una ruta ecológica, rentable y biocompatible. En el presente estudio se caracterizaron e investigaron las CuONP biosintetizadas en cuanto a su toxicidad. El análisis morfológico mediante TEM, SEM y AFM mostró un tamaño de partícula esférica de 20,7 nm con 96% de cobre que confirmó la pureza de las CuONP. Las CuONP biogénicas con un valor de CI50 de 64,6 µg ml-1 mostraron un 90 % de eliminación de radicales libres en el ensayo de eliminación de radicales superóxido. Las CuONP mostraron una actividad antiinflamatoria mejorada en un 86 % de la desnaturalización de proteínas con un valor de IC50 de 89,9 µg ml-1. Las CuONP biogénicas exhibieron una toxicidad significativa contra cepas bacterianas con un valor de CIM más bajo de 62,5 µg ml-1 para B. cereus y una cepa fúngica con un valor de CIM de 125 µg ml-1 para C. albicans. Además, las CuONP demostraron un alto grado de interacción sinérgica cuando se combinaron con fármacos estándar. Las CuONP exhibieron una citotoxicidad significativa contra el cáncer de pulmón de células no pequeñas con un valor de CI50 de 100,8 µg ml-1 para A549 y 88,3 µg ml-1 para la línea celular H1299 con actividades apoptóticas. Además, se evaluó el potencial de degradación fotocatalítica de las CuONP biogénicas contra el tinte azul de metileno y pudieron eliminar el 94% del tinte en 90 minutos. El análisis de eliminación de radicales libres sugirió que las CuONP asistieron a la degradación del tinte fue inducida principalmente por radicales hidróxido. Las CuONP biogénicas aparecen como un fotocatalizador ecológico y rentable para el tratamiento de aguas residuales contaminadas con tintes sintéticos que representan una amenaza para la biota acuática y la salud humana. El presente estudio destacó la combinación de potencial biomédico y fotocatalítico de las CuONP derivadas de Formidio como un enfoque atractivo para futuras aplicaciones en nanomedicina y biorremediación.

En todo el mundo, el uso de nanopartículas (NP) en el campo biomédico atrajo la atención de los investigadores. La pequeña relación superficie-volumen en comparación con el material a granel es responsable de sus propiedades mejoradas o únicas. Ya que permite que las NP interactúen con un alto grado de especificidad y mayor eficacia para combatir enfermedades infecciosas1,2. Entre los diversos óxidos metálicos, las nanopartículas de óxido de cobre (CuONP) ganaron un gran interés debido a su alta estabilidad, mayor vida útil, alta eficiencia cuántica y actividad antimicrobiana. La amplia aplicación biomédica de las CuONP como actividades antioxidantes, antimicrobianas, antiinflamatorias, antivirales, citotóxicas y anticancerígenas las ha convertido en fuertes candidatos para su uso como agentes terapéuticos3,4,5,6,7. Una vida útil más larga y una mayor estabilidad también convierten a los CuONP en el candidato adecuado en biotecnología ambiental para la purificación del agua y la eliminación de contaminantes de efluentes industriales sin la formación de subproductos nocivos8. En el cuerpo humano, el cobre (Cu) está presente en oligoelementos que se encuentran en enzimas como la superóxido dismutasa, la citocromo oxidasa y la tirosinasa6. Además, sirve como cofactor para múltiples enzimas responsables de la producción de neuropéptidos, el mecanismo de señalización celular, el estrés oxidativo y la función de las células inmunitarias en humanos9.

La síntesis de CuONP se puede realizar mediante varios procesos físicos, químicos y biológicos. Los enfoques de síntesis física y química adolecen de inconvenientes como reactivos costosos, condiciones de reacción peligrosas, mayor tiempo, procesos tediosos para aislar las NP y daños a los ecosistemas y a la salud humana10,11. Por lo tanto, para superar estas deficiencias, para la fabricación de NP se utilizó el principio de la química verde que utiliza recursos naturalmente disponibles como virus, bacterias, cianobacterias, hongos, algas y plantas12. Las cianobacterias (algas verdiazules) forman uno de los grupos ancestrales más grandes y primitivos con estructuras de células procarióticas que tienen la capacidad de realizar una fotosíntesis dependiente del dióxido de carbono. Las cianobacterias han recibido mucha atención científica por su capacidad para sintetizar NP, no sólo por su alta eficiencia de biomasa, sino también por su potencial para biorremediar metales peligrosos y transformarlos en formas más manejables13. Estos son capaces de sintetizar NP inorgánicas y de óxidos metálicos, por ejemplo, nanopartículas de selenio, zinc, platino, paladio, oro y plata14,15,16,17,18. La síntesis de NP facilitada por las cianobacterias se produce de forma extracelular, que implica la producción de la enzima reductasa debido a interacciones electrostáticas, y de forma intracelular, es decir, dentro de las células, mediante la actividad de las enzimas13.

Hasta donde sabemos, los estudios sobre aplicaciones biomédicas de CuONP son limitados, lo que nos llevó a realizar el presente estudio para desentrañar la evaluación toxicológica de CuONP sintetizadas biológicamente. En el presente estudio, las CuONP se sintetizaron biológicamente utilizando extracto celular de cianobacterias (Phormidium sp.) y se caracterizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía electrónica de transmisión (TEM), espectro de rayos X de energía dispersiva (EDX), difracción de rayos X (XRD). ), microscopía de fuerza atómica (AFM), espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) y análisis UV-Vis. Se estudiaron las CuONP sintetizadas para determinar sus propiedades antioxidantes, antimicrobianas y antiinflamatorias. Se probó la citotoxicidad de las CuONP contra dos líneas celulares de cáncer de pulmón humano, A549 y H1299, y se estudiaron estudios de apoptosis. Además, la actividad fotocatalítica se realizó para promover el uso de CuONP derivadas de formidio como un aspecto ecológico capaz de combatir eficazmente la degradación del tinte.

Según el tiempo de retención, los picos de los espectros de masas se identificaron con la ayuda de la biblioteca NIST/Wiley. Perfil GC-MS de Phormidium sp. El extracto celular mostró 19 compuestos: ésteres de ácidos grasos (94,5%), ácido carboxílico (1,42%), ésteres (0,84%), alquenos (1,75%), fenólicos (0,29%), alcanos (1,40%) y otros (Fig. S1). ; Tabla S1). Se observaron tres picos principales de ésteres de ácidos grasos, es decir, el pico 1 con un área del 21,09 % para el éster metílico del ácido 9,12-octadecadienoico, el pico 2 con un área del 17,06 % para el éster metílico del ácido 9-octadecenoico y el pico 3 con un área del 12,7 % para el hexadecanoico. ácido, éster metílico.

El cambio de color de la solución de verde oscuro a marrón oscuro indicó la síntesis de CuONP (Fig. S2). Las CuONP derivadas de cianobacterias exhibieron el pico de absorción máximo a 265 nm, lo que confirmó la formación de CuONP en la solución y no se determinó ninguna banda de absorción para el sulfato de cobre y el extracto celular en la misma región (Fig. 1a).

Caracterización de Phormidium sp. CuONP derivadas; (a) espectro UV-visible; (b) espectro FTIR; (c) difractograma de rayos X; (d) Análisis SEM con un aumento directo de × 10 000; (e) gráfico EDX y (f) micrografía TEM. El recuadro en el panel (a) muestra el color verde del extracto celular y la forma en polvo de CuONP.

Análisis FTIR de CuONP y Phormidium sp. Se realizó un extracto celular (Fig. 1b). El pico amplio observado a 3388 cm-1 en el extracto celular corresponde al estiramiento –OH de los compuestos fenólicos en el extracto celular. El pico fino a 2969 cm-1 se atribuyó al modo de estiramiento –CH2 y C-H en los alcanos. El intenso pico observado alrededor de 1657 cm-1 puede atribuirse a las vibraciones de estiramiento de las proteínas (amida I), mientras que la banda a 1536 cm-1 es característica de la amida II. El pico a 1452 cm-1 es característico del estiramiento CN de aminas alifáticas. El pico alrededor de 1402 cm-1 muestra la presencia de ácido carboxílico -COO presente en el extracto celular. El pico agudo a 1089 cm-1 corresponde a la presencia de vibraciones de estiramiento de ácidos carboxílicos y grupos amino. El pico estrecho observado a 597 cm-1 se puede atribuir a las vibraciones de flexión del CuO, lo que confirma la formación de CuONP de alta pureza.

El análisis XRD mostró los picos prominentes en 35,5°, 38,7°, 48,7°, 53,6°, 58,2° y 61,5° que se atribuyen a los índices de Miller-Bravais de (111), (110), (200), (202), (222) y (003), respectivamente (Fig. 1c). Los picos de difracción observados de los CuONP cumplen bien con los del patrón de CuO del Comité Conjunto sobre Estándares de Difracción de Polvo (JCPDS, tarjeta No. 89-1461), que puede indexarse ​​a la estructura cristalina hexagonal de wurtzita de los CuONP. La información detallada de los medios máximos de ancho completo (FWHM), los índices de Miller, el espaciado d en nanómetros y el tamaño de los gránulos D de las CuONP biogénicas se indexaron en la (Tabla S2). Según el pico de difracción más intenso en 2θ = 38,7° (110), se encontró que el tamaño promedio de partícula de CuONP era 22,5 nm utilizando la ecuación de Debye-Scherrer19. Además, no se detectaron picos adicionales en el patrón XRD, lo que demuestra que las CuONP sintetizadas mediante el método biogénico son significativamente puras.

El análisis SEM mostró CuONP de tamaño 28,5 ± 2,5 nm (Fig. 1d). El espectro EDX dio una señal fuerte a 8 keV con 96% en peso de cobre (Fig. 1e), lo que significó la presencia de cobre. Se encontró que el tamaño promedio de las CuONP mediante TEM era de 20,7 ± 2,2 nm con forma esférica u ovalada (Fig. 1f). El análisis AFM con corrección de punta mostró CuONP de forma esférica/ovalada en el rango de 0 a 22,5 nm. El resultado mostró la vista 2D y 3D de la superficie de la muestra en un escaneo de 0,7 × 0,7 µm y una distribución de altura uniforme (Fig. 2a, b).

Resultados de microscopía de fuerza atómica (AFM) de CuONP derivadas de formidio (a) Imagen AFM sin filtrar que muestra una imagen topográfica 2D; (b) imagen 3D. Análisis del tamaño de partículas de CuONP (c) Distribución de tamaños mediante analizador de tamaño Zeta; (d) Distribución potencial Zeta.

El análisis DLS sugirió la distribución de tamaño de CuONP en el rango de 68,7 ± 3,4 nm (Fig. 2c). Las sustancias adsorbidas en la superficie de las nanopartículas (p. ej., estabilizadores) y el espesor de la doble capa eléctrica (capa de solvatación), que se mueven junto con la partícula, hacen que el tamaño sea mayor en comparación con las técnicas microscópicas SEM y TEM20. El índice de polidispersidad (PDI) de las CuONP fue de 0,220, lo que indicó que estas partículas están moderadamente dispersas. Según el analizador manual Malvern Zeta, el valor de PDI inferior a 0,05 representa distribuciones de NP altamente monodispersas y el valor de PDI superior a 0,7 indica distribuciones polidispersas de NP. Los cálculos utilizados para la determinación del tamaño y los parámetros PDI se definen en los documentos estándar ISO 13,321:1996 E e ISO 22,412:2008 (Manual—Malvern Zeta Size Analyzer)21. Se encontró que el potencial zeta de las CuONP era − 21,1 mV (Fig. 2d).

En el presente estudio, se comparó la actividad antioxidante del extracto acuoso libre de células, las CuONP y el ácido ascórbico estándar mediante ensayos ABTS, DPPH, SOR y H2O2 y se calcularon las concentraciones a las que se realizó una eliminación del 50 % (IC50) de radicales libres. Sus actividades de eliminación de radicales libres aumentaron de manera dependiente de la dosis (Fig. 3 y Tabla 1). El orden de actividad antioxidante (% de inhibición de la eliminación) fue: SOR > H2O2 > DPPH > ABTS. El valor de CI50 calculado a partir del porcentaje de inhibición de la eliminación de radicales libres reveló que las CuONP mostraron valores de CI50 más altos que el ácido ascórbico estándar pero más bajos que el extracto libre de células, lo que indica su naturaleza antioxidante superior.

Actividad antioxidante del extracto libre de células, CuONP biogénicas y ácido ascórbico mediante diferentes ensayos de eliminación; a) ABTS; (b) DPPH; (c) peróxido de hidrógeno; (d) SOR. Los experimentos fueron realizados por triplicado; las barras representan la media de los valores y las barras de error representan la media ± DE (*P < 0,05).

Se observó una inhibición constante de los radicales libres ABTS·+ (3,9% ± 0,5 a 86,33% ± 0,8) por CuONP en concentraciones que oscilaron entre 25 y 125 µg ml-1 y los correspondientes valores de CI50 para CuONP, extracto y ácido ascórbico (estándar). Se calcularon (Fig. 3a y Tabla 1). La actividad de eliminación de radicales DPPH en un rango de concentración de 25 a 125 µg ml-1 mostró un porcentaje de eliminación que oscilaba entre 23,5% ± 1,08 y 79,6% ± 0,4, que depende directamente de la tendencia de la muestra a donar hidrógeno al radical DPPH y se calcularon los valores de IC50 correspondientes (Fig. 3b y Tabla 1).

Las CuONP biogénicas mostraron una inhibición significativa dependiente de la dosis para todos los patógenos microbianos (Fig. 4a-d). Se observó una mayor inhibición contra bacterias Gram positivas (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) que contra bacterias Gram negativas (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae) con el valor de CIM más bajo de 62,5 µg ml-1 contra B. cereus (Tabla 2). Se observaron resultados similares contra patógenos fúngicos como porcentaje de inhibición con inhibición máxima contra C. albicans con un valor de CIM de 125 µg ml-1 (Fig. 4e,f; Tabla 3).

El efecto inhibidor de Phormidium sp. CuONP derivadas y extracto celular; (a) E. coli; (b) K. neumonía; (c) B. cereus; (d) S. aureus; (e) C. albicans y (f) C. glabrata. Los experimentos fueron realizados por triplicado; las barras representan la media de los valores y las barras de error representan la media ± DE (*P < 0,05).

Además, se determinó la acción sinérgica para describir la interacción de agentes antimicrobianos, en la que el efecto producido por los fármacos en combinación fue mayor que sus efectos individuales22. Los índices de interacción (sinérgica/antagonista) para cada combinación se determinaron mediante métodos de tablero de ajedrez. Se calcularon los índices de concentración inhibidora fraccional (FIC) contra bacterias patógenas en combinación con CuONP y estreptomicina (Tabla 2). El grado de sinergia fue mayor para las especies Gram negativas que para las Gram positivas. Se observaron resultados similares contra C. albicans y C. glabrata con CuONP y fluconazol (Tabla 3). Se resumió el posible mecanismo que se esconde detrás de la acción antimicrobiana mejorada de las CuONP (Fig. 5).

Los mecanismos antimicrobianos propuestos inducidos por CuONP para la inhibición en células bacterianas y fúngicas.

La inhibición máxima de la desnaturalización de proteínas observada fue del 86,3% ± 0,33 con 150 µg ml-1 de CuONP (Fig. S3). La aspirina (ácido acetilsalicílico), un fármaco inflamatorio estándar, mostró una inhibición máxima del 93,8% ± 1,11 a una concentración de 100 µg ml-1. Se encontró que la CI50 de la aspirina y las CuONP era 34,9 ± 0,87 y 89,9 ± 0,21 µg ml-1, respectivamente.

La biocompatibilidad de las CuONP contra las líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (H1299 y A549) se evaluó mediante el ensayo MTT. Las CuONP redujeron la viabilidad de las líneas celulares cancerosas A549 y H1299 de manera dependiente de la dosis después de 24 h de exposición (Fig. 6c).

Efecto citotóxico de las CuONP derivadas de Formidio a una concentración de CI50 contra la línea celular de cáncer de pulmón (a) H1299 (control y tratada); (b) A549 (control y tratado); (c) efecto citotóxico de las CuONP contra las líneas celulares de cáncer de pulmón A549 y H1299 en diferentes concentraciones. Los experimentos fueron realizados por triplicado; las barras representan la media de los valores y las barras de error representan la media ± DE (*P < 0,05).

Los valores de IC50 calculados para las CuONP biogénicas fueron 100,8 ± 1,24 µg ml-1 para H1299 y 88,3 ± 0,74 µg ml-1 para la línea celular A549. Los valores de IC50 para el fármaco estándar (doxorrubicina) fueron 0,94 ± 0,55 μg ml-1 contra H1299 y 1,80 ± 0,05 μg ml-1 para las células A549, respectivamente. La apoptosis inducida por el tratamiento con CuONP conduce a cambios conformacionales visualizados por la tinción DAPI, ya que las ampollas, la condensación y el agrietamiento de los núcleos constituyen los rasgos característicos de la apoptosis (Fig. 6a, b). Las células sin tratamiento (control) mostraron núcleos intactos con bordes lisos que tenían forma y tamaño uniformes en ambas líneas celulares.

Para investigar la actividad fotocatalítica de las CuONP, el colorante orgánico MB se sometió a fotodegradación utilizando CuONP biogénicas (5, 10, 15, 20 y 25 mg/l). El control mantenido en oscuridad no mostró ningún cambio de color visual. Pero las mezclas de reacción complementadas con CuONP a la luz del sol mostraron un cambio de color de azul oscuro a azul pálido. El escaneo UV-Vis de la suspensión de reacción para MB a 665 nm mostró que la altura del pico disminuyó con el aumento del tiempo, lo que sugirió una mayor degradación del tinte con el tiempo (Fig. 7a). La degradación máxima del tinte MB (94%) se observó después de 90 minutos (Fig. 7b).

Fotodegradación del tinte azul de metileno (MB), (a) Efecto de la irradiación solar usando CuONP sobre la degradación fotocatalítica del tinte MB; (b) Porcentaje de degradación fotocatalítica del tinte MB como efecto del tiempo con carga variable de fotocatalizador (CuONP); (c) Fotodegradación del tinte versus tiempo de irradiación con fotocatalizador variable (CuONP) medido por absorción óptica; (d) Gráfico de ln(C0/C) frente al tiempo de irradiación para la cinética de degradación del tinte.

Para la identificación de radicales libres inducidos por CuONP durante la fotodegradación del tinte, se realizaron estudios de eliminación mediante la adición de oxalato de amonio (AO) como eliminador de h+, p-benzoquinona (p-BQ) como eliminador de O2− y terc-butanol (t- BuOH) como eliminador de OH en las suspensiones de reacción. La adición de AO mostró un cambio mínimo en la degradación fotocatalítica de los tintes, lo que indica que los radicales h+ desempeñaron muy poco papel en la degradación (Fig. S4). La adición de p-BQ (eliminador de O2−) mostró una mayor reducción que los radicales h+, lo que indica su papel relativamente mayor en la degradación del tinte. Sin embargo, la tasa de degradación del tinte MB se redujo como máximo hasta un 65% con la adición de t-BuOH (eliminador de OH-) y sugirió que los radicales hidroxilo estaban involucrados principalmente en la degradación del tinte. La disminución de la tasa de eliminación en presencia de carroñeros presenta la siguiente tendencia: t-BuOH > p-BQ > AO. Para estudiar cuantitativamente la actividad fotocatalítica de las CuONP, realizamos las gráficas de ln (C / C0) versus el tiempo de irradiación, asumiendo que la reacción de degradación del tinte por las CuONP bajo irradiación con luz visible siguió la cinética de pseudo primer orden. Se puede modelar como:

donde Kabs es la constante de velocidad de fotodegradación (min-1), C0 es la concentración inicial de MB y tinte y Ct es la concentración de tinte en el tiempo t23. Utilizando una concentración inicial de tinte MB de 25 mg / L y una carga de fotocatalizador variable, se trazaron las líneas de mejor ajuste de ln (C0 / Ct) versus el tiempo (Fig. 7c, d). La naturaleza lineal de nuestros datos confirmó que la fotodegradación del tinte MB utilizando fotocatalizadores encaja bien con el modelo cinético. Vale la pena señalar que la concentración de tinte en estos experimentos permanece en el régimen óptico donde se cumple la ley de Beer-Lambert. Todos los valores del coeficiente de correlación (R2) fueron superiores a 0,95 con un valor promedio de 0,96 para la degradación fotocatalítica del tinte MB. Nuestros resultados confirmaron la aplicabilidad del modelo cinético de reacción de pseudo primer orden para la degradación fotocatalítica del colorante MB. Suponiendo la cinética de reacción, la constante de velocidad más alta (k) determinada a partir de la pendiente de las gráficas lineales de ln(C0/Ct) versus el tiempo, correspondiente a la carga óptima de catalizador (CuONP) de 10 mg/L, fue de 0,026 min-1 para el tinte MB.

La síntesis de CuONP biogénicas recibió atención mundial debido a sus amplias aplicaciones en biomedicina. Durante la presente investigación, las CuONP se sintetizaron utilizando el extracto acuoso crudo libre de células de cianobacterias (Phormidium). La biosíntesis extracelular de CuONP es mucho más económica que la síntesis intracelular debido al uso de productos químicos, la energía y el tiempo necesarios para la alteración y purificación celular. El análisis GC-MS del extracto celular de Phormidium mostró la presencia de varios compuestos de principios activos que pueden ayudar en la síntesis de CuONP. Estos compuestos también se informaron previamente en el perfil GC-MS de Nostoc sp. EA0324 y Synechocystis sp. PCC 733825, y sugirió su naturaleza reductora. Ésteres de ácidos grasos, a saber, éster metílico del ácido octadecanoico y éster metílico del ácido 13-docosenoico se encontraron en menor cantidad (1,74% y 0,64% respectivamente). Los derivados de estos ésteres de ácidos grasos con potencial reductor también se han encontrado en Allium saralicum26 y Citrus Wax27. En el extracto de cianobacterias también se encontraron ésteres como el éster metílico del ácido heptadecanoico y el éster metílico del ácido octadecenoico (Z). También se informó que el éster metílico del ácido heptadecanoico de Mentha spicata28 y el éster metílico del ácido octadecenoico (Z) de Thesium humile29 tienen un buen potencial reductor. Aparte de los ésteres, también se identificaron en el extracto algunos ácidos carboxílicos, es decir, ácido metacrílico (0,13%) y ácido 1,2-bencenodicarboxílico (0,22%). Anteriormente, la naturaleza reductora de estos dos ácidos carboxílicos se informó en las especies Calothrix brevisima30 y Punica31. Compuestos de otras clases como alcano (nonadecano), alqueno (neofitadieno, 1, 3, 12-nonadecatrieno), derivados de cicloalqueno (ciclododecino, triciclo [20.8.0.0(7,16)] triacontano y 1,1':3',1 "-terciclopentano, 2'-dodecil), derivado de acetanilida (acetamida, N-(3,5-diaminofenil) y fenol (Phytol) también se obtuvieron en el presente estudio utilizando extracto de células de Phormidium sp. También se informaron compuestos con buena capacidad reductora como neofitadieno de Plectranthus amboinicus32, 5-(1,5-dimetil-4-hexenilo de Zingiber officinal33, fenol, 3,5-bis(1,1-dimetiletilo de Calothrix brevisimma30. El fito -Las sustancias químicas presentes en el extracto de cianobacterias, como clorofila, carotenoides, ficobiliproteínas, flavonoides, fenoles y proteínas, actúan como agentes reductores y estabilizantes (protectores) para la síntesis de NP 34. Los flavonoides tienen la capacidad de donar hidrógeno o electrones, y los fenólicos exhiben un efecto quelante sobre los iones metálicos, que es responsable de la reducción de Cu2+ de CuSO4.5H2O a nanopartículas de óxido de cobre35. Las proteínas presentes en el extracto se unen a las nanopartículas a través de grupos amina libres o residuos de cisteína o grupos carboxilato de enzimas cargados negativamente que ayudan en la síntesis y estabilización de las nanopartículas. Aún no se ha explorado la naturaleza química exacta del agente reductor y bloqueador para las CuONP. Pero con respecto a las nanopartículas de CdS derivadas de Phormidium tenue NTDM05, se informa que la proteína ficobilina fluorescente previene la aglomeración de nanopartículas36. Las CuONP sintetizadas a partir de cianobacterias exhibieron diferentes λ max, por ejemplo, a 259 nm en Spirulina platensis37, 600 nm en Phormidium sp.38, 220 nm en Cylindrospermum stagnale39 y 580 nm en Spirulina platensis40. Además, las CuONP de otros organismos han mostrado un λ max ligeramente diferente, por ejemplo, a 282 nm en Punica granatum41, 250 nm en Achillea millefolium3, 260 nm en Aloe vera42, 265 nm en Aloe barbadensis Miller43, 250 nm en Caesalpinia bonducella44, 245 nm en Momordica. charantia5 y 277 nm en Citrofortunella microcarpa45.

Las CuONP biogénicas se purificaron aún más para la eliminación de biomoléculas no deseadas mediante centrifugación después de 3 h. Luego se realizó la caracterización física mediante análisis XRD, SEM, EDX, TEM, AFM y DLS. En el análisis FTIR los picos obtenidos en Phormidium sp. Las CuONP derivadas mostraron grupos funcionales que pueden haber servido como agentes reductores y protectores durante su síntesis (Fig. 1b). Otros investigadores también informaron observaciones similares, por ejemplo, un pico de 574 cm-1 en el extracto de flor de Millettia pinnata4, de 540 cm-1 en el extracto acuoso de frijol negro46, un pico de 576 cm-1 en el alga parda Cystoseira trinodis11, 590 cm-1 en Momordica. extracto acuoso de charantia5 y 529 cm−1 en extracto de hojas de Aloe vera42. El pico observado a 875 cm-1 puede atribuirse a la flexión del CH aromático. En el extracto de hojas de Citrofortunella microcarpa se informó un pico idéntico a 880 cm-145. Esto indica que la molécula biológica presente en el extracto celular tiene una doble función de estabilización y formación de CuONP. Análisis XRD de CuONP de Phormidium sp. El extracto celular mostró picos bien definidos en el valor 2θ que indicaban su naturaleza cristalina (Fig. 1c). Cuando el tamaño cristalino disminuye desde dimensiones masivas hasta dimensiones nanométricas, los picos de XRD se amplían19. El resultado de XRD mostró que las CuONP formadas son de naturaleza cristalina con un tamaño promedio de 22,5 nm cercano al tamaño de partícula medido por TEM. Varias CuONP sintetizadas biológicamente también mostraron la naturaleza cristalina, a saber, de las cianobacterias Phormidium47, Spirulina platensis37, el alga parda Cystoseira trinodis11 y Bifurcaria bifurcate48. Las plantas superiores también exhibieron la naturaleza cristalina de CuONP biosintetizadas, por ejemplo, extracto de hojas de Aloe barbadensis Miller43, extracto de semillas de Caesalpinia bonducella44 y extractos de hojas de Achillea millefolium3. Se realizó microscopía electrónica de barrido con rayos X de dispersión de energía (SEM-EDX) para confirmar la presencia de cobre elemental en CuONP sintetizadas biológicamente. La presencia de cobre (96%) y oxígeno en el análisis EDX confirmó la pureza de las CuONP sintetizadas (Fig. 1d, e).

También se realizaron análisis TEM y AFM para determinar el tamaño y la topología de la superficie (Figs. 1f y 2b). Se han informado CuONP de diferentes formas y tamaños a partir de cianobacterias, por ejemplo, Phormidium, Spirulina platensis y Bifurcaria bifurcaron CuONP de forma cuasi esférica sintetizadas en el rango de 40 a 45 nm37,47,48. Otros estudios sobre síntesis mediada por plantas superiores han informado de una menor pureza, por ejemplo, las CuONP sintetizadas a partir de extracto de Aloe vera exhibieron un 54% de cobre elemental con un tamaño de 30 nm con algunas partículas más grandes (100 nm)42. Las CuONP sintetizadas a partir de Momordica charantia mostraron un tamaño promedio de 61,4 nm con 54,5% de cobre5. Además, se han informado CuONP esféricas de gran tamaño en Citrofortunella microcarpa (68–75 nm)45 y en actinomicetos (61,7 nm)49. Se utilizó la dispersión dinámica de la luz (DLS) para determinar los tamaños hidrodinámicos, las polidispersidades y los efectos de agregación de la muestra coloidal basándose en el movimiento browniano20. Es el comportamiento de difusión de partículas dentro de cualquier fluido, medido por las fluctuaciones en la intensidad de la luz que pasa a través de una solución coloidal en función del tiempo50. La distribución de tamaño de CuONP está en el rango de 68,7 ± 3,4 nm (Fig. 2c). El valor de PDI obtenido de 0,2 para las CuONP sugirió su naturaleza intermedia o moderada. Según el analizador manual Malvern Zeta, el valor de PDI inferior a 0,05 representa distribuciones de NP altamente monodispersas y el valor de PDI superior a 0,7 indica distribuciones polidispersas de NP21. Además, se realizó una medición del potencial zeta para verificar la estabilidad de las CuONP sintetizadas (Fig. 2d). Se considera una medida de cargas en la superficie de las nanopartículas. Las cargas grandes positivas (> + 30 mV) o negativas (≥ 30 mV) tienden a repelerse entre sí, mientras que un valor de potencial zeta bajo provoca la agregación de NP debido a la ausencia de fuerza repulsiva y proporciona estabilidad a las nanopartículas17. Qamar et al.5 sintetizaron CuONP a partir del extracto de hoja de Momordica charantia con un potencial zeta de −7,23 mV solamente. El valor más negativo del potencial zeta de las CuONP derivadas de Formidio sugirió su mayor estabilidad.

Las cianobacterias y muchas plantas medicinales poseen restos captadores de radicales libres, como compuestos fenólicos, terpenoides, flavinoides, vitaminas y otros metabolitos endógenos, que son ricos en actividad antioxidante51. Las CuONP derivadas de formidio mostraron un mayor porcentaje de eliminación de radicales libres. La respiración celular conduce a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y varios otros radicales libres que tienen electrones desapareados en la capa de valencia. Estos radicales libres desempeñan un papel vital en la señalización celular, pero en exceso provocan daño oxidativo a la célula al reaccionar con los componentes celulares que causan cáncer, envejecimiento, cataratas, enfermedades cardiovasculares y disfunción de los órganos. Por lo tanto, los antioxidantes desempeñan un papel crucial para regular y eliminar los radicales libres antes de que dañen la célula52. El presente estudio mostró la actividad antioxidante de las CuONP mediante ensayos ABTS, DPPH, SOR y H2O2. ABTS·+ es un radical libre pregenerado y la interacción entre el antioxidante y ABTS·+ provoca el blanqueo de ABTS·+17. Las CuONP mostraron un porcentaje de inhibición del 3,9 al 86,33% y se calcularon los valores de CI50 correspondientes para las CuONP, el extracto y el ácido ascórbico (estándar) (Fig. 3a y Tabla 1). Kumar y Shanmugam53 también informaron una inhibición del 88% ± 1,12 de los radicales libres ABTS·+ con 500 µg ml-1 de CuONP sintetizadas mediante el uso de extracto floral de Magnolia champaca.

En la eliminación de radicales DPPH, las CuONP mostraron un porcentaje de inhibición que oscilaba entre el 23,5 y el 79,6% y se calcularon los valores de CI50 correspondientes (Fig. 3b y Tabla 1). En informes anteriores, las CuONP derivadas de Cystoseira trinodis (alga parda), Solanum nigrum y Mussaenda frondosa exhibieron una inhibición de eliminación del 50 % con un valor de CI50 de 543 µg ml-1, 131,5 µg ml-1 y 1570 µg ml-1, respectivamente8,11. 54.

Se observó una inhibición significativa dependiente de la dosis con CuONP biogénicas contra cepas bacterianas (Fig. 4a-d). Karuppannan et al.55 sintetizaron CuONP a partir del extracto de Cardiospermum halicacabum y exhibieron acción antibacteriana con un valor de CIM de 1 mg ml-1 para S. aureus y E. coli. Manasa et al.54 sintetizaron CuONP de Mussaenda frondosa L que exhibieron potencial antibacteriano con un valor de CIM de 305 µg ml-1 contra E. coli. Además, las CuONP sintetizadas a partir del extracto de algas pardas de Bifurcaria bifurcate48 y del extracto de cianobacteria Spirulina platensis37 mostraron potencial antibacteriano contra S. aureus, B. cereus, E. coli y K. pneumonia por difusión en disco. Las CuONP sintetizadas a partir de actinomicetos49, extractos de hojas de Achillea millefolium3 y Momordica charantia5 exhibieron actividad antibacteriana con zonas máximas de inhibición. Sin embargo, las CuONP sintetizadas mecánicamente también mostraron actividad antibacteriana, pero con un valor de CIM más alto de 2,5 mg ml-1 para S. aureus y 3,75 mg ml-1 para E.coli56. Las CuONP sintetizadas utilizando extracto de hoja de Psidium guajava exhibieron una actividad antibacteriana mejorada contra cepas bacterianas gram negativas (E. coli, P. aeruginosa) y gram positivas (S. pneumoniae, S. epidermidis) usando difusión en pozos de agar, y se demostró la interacción de las CuONP con la membrana bacteriana. mediante microscopio de barrido láser confocal (CLSM)57. Las CuONP sintetizadas utilizando extracto de hoja de Abutilon indicum mostraron actividad antibacteriana contra las bacterias E. coli, S. typhi, B. subtilis y S. aureus mediante el método de difusión en pozo de agar58. Se conocían estudios limitados en la literatura sobre la actividad antifúngica de las CuONP con referencia a especies de Candida. CuONP sintetizadas a partir de extractos de hojas de Achillea millefolium3, Brassica oleracea var. El extracto59 y las CuONP60 sintetizadas químicamente exhibieron una potente actividad antifúngica contra C. albicans y C. glabrata. Sin embargo, las CuONP sintetizadas comercialmente mostraron actividad antifúngica con un valor de CMI de 1 mg ml-1 para C. albicans y C. glabrata61. Nuestros resultados resaltan la presencia de interacciones sinérgicas entre CuONP y combinaciones de antibióticos/fungicidas (Tablas 2 y 3). El posible mecanismo detrás de la acción antimicrobiana sinérgica mejorada de las CuONP puede deberse a la participación de grupos funcionales activos como los grupos hidroxilo y amino presentes en los antibióticos/fungicidas que pueden ser quelados por las CuONP22,62. Dado que las CuONP tienen propiedades antimicrobianas potenciales con potencial sinérgico, pueden usarse en la conservación y envasado de alimentos. El mecanismo antimicrobiano de las CuONP puede deberse a la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que alteran la membrana celular y causan toxicidad celular directa63. Los posibles mecanismos implicados por la actividad antimicrobiana inducida por las CuONP se pueden resumir como (Fig. 5). El grupo carboxílico y aminas presentes en la membrana celular facilita la penetración de CuONP mediante la disolución intracelular de iones de cobre solubles y la acumulación de superóxidos o radicales hidroxilo que conducen al estrés oxidativo. Las CuONP generan una potente citotoxicidad por daño al ADN, degradación mitocondrial, alteración de los ribosomas y disfunción de diferentes canales de proteínas presentes en la membrana celular que conduce a la muerte celular64,65.

La inflamación es un proceso complejo, asociado con dolor e implica un aumento de la desnaturalización de proteínas, la permeabilidad vascular y la alteración de las membranas. Durante la desnaturalización, las proteínas pierden su estructura secundaria y terciaria debido al estrés o al calor que provoca inflamación. Hay informes limitados disponibles sobre la actividad antiinflamatoria de las CuONP. La desnaturalización máxima de proteínas observada fue del 86,3% con 150 µg ml-1 de CuONP (Fig. S3) y se encontró que la CI50 de la aspirina y las CuONP era 34,9 ± 0,87 y 89,9 ± 0,21 µg ml-1, respectivamente. Thiruvengadam et al.4 observaron un 80% de desnaturalización de la albúmina por las CuONP sintetizadas utilizando extracto de flor de Millettia pinnata. Las CuONP biosintetizadas utilizando Triumfetta rotundifolia exhibieron un 57,4 % de estabilización de la membrana de los glóbulos rojos humanos a 1 mg ml-1 y un 58 % a 100 mg ml-1 utilizando un extracto de Mussaenda frondosa L.54,66. Las CuONP sintetizadas utilizando extracto de hoja de Bacopa monnieri exhibieron actividad antiinflamatoria in vivo con una inhibición del edema del 74 % en comparación con el diclofinaco sódico estándar del 24 % después de 48 h67. Las CuONP sintetizadas utilizando extracto de hoja de Cissus quadrangularis mostraron una mayor actividad antiinflamatoria en la estabilización de la membrana y actividad antiproteinasa en comparación con el fármaco estándar68. También se probaron las CuONP sintetizadas químicamente para determinar su actividad antiinflamatoria tanto in vitro como in vitro en ratones albinos. Los resultados mostraron que las CuONP inhibieron altamente la desnaturalización de BSA en la actividad antiinflamatoria in vitro y la actividad in vivo reveló que las dosis bajas (5 mg/kg) de CuONP eran más potentes para inhibir la inflamación que las dosis altas (10 y 20 mg). /kg) de fármacos libres69.

La citotoxicidad de las CuONP contra las líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas (H1299 y A549) se evaluó mediante el ensayo MTT. Se observó una actividad anticancerígena apreciable contra las células A549 con un valor de IC50 más bajo que las células H1299 (Fig. 6c). La tinción DAPI se realizó para determinar la apoptosis causada por CuONP en líneas celulares que mostraban ampollas y condensación de los núcleos en las células tratadas (Fig. 6a, b). Manasa et al.54 mostraron un valor de CI50 de 218,18 µg ml-1 de las CuONP biosintetizadas utilizando extractos de Mussaenda frondosa L. contra células cancerosas A549. Las CuONP sintetizadas a partir del extracto de Ficus religiosa evaluadas contra la línea celular A549 mediante el ensayo MTT mostraron un valor de CI50 de 200 μg ml-170. Las CuONP sintetizadas en verde a partir del extracto de hoja de Ficus religiosa inhibieron el nivel de histonas desacetilasas (HDAC) y exhibieron actividad anticancerígena mediada por apoptosis contra la línea celular de cáncer de pulmón A549 con un valor de IC50 de 200 μg ml-171. Las CuONP sintetizadas utilizando extracto de hoja de Abutilon indicum exhibieron citotoxicidad contra las líneas celulares de cáncer de pulmón humano A549 y de mama MDA-MB-231 mediante el ensayo MTT58. La actividad anticancerígena mediada por CuONP implica estrés oxidativo, acumulación de ROS, aberración cromosómica, fragmentación del material genético, producción de caspasas y mejora de las vías apoptóticas intrínsecas y extrínsecas64. Las CuONP causaron daños en el ADN, detuvieron el ciclo celular e inhibieron la proliferación celular en las células HeLa del cáncer de cuello uterino72. Las CuONP sintetizadas utilizando actinomicetos entofíticos marinos mostraron citotoxicidad contra células de cáncer de pulmón A549 en una concentración de 500 µg ml-1 con 54% de inhibición y una morfología irregular de las células cancerosas73. Además, Singh et al.74 y Elsayed et al.75 observaron las CuONP verdes sintetizadas como una actividad antiproliferativa eficaz en el tratamiento del cáncer de mama específico. Los valores más bajos de IC50 de las CuONP derivadas de Phormidium contra líneas celulares cancerosas (significativos en P ≤ 0,05) ponen claramente de manifiesto el hecho de que las CuONP biosintetizadas tienen una citotoxicidad potente.

La actividad fotocatalítica de las CuONP se realizó utilizando colorante MB en diferentes concentraciones (5, 10, 15, 20 y 25 mg/L) y mostró un cambio de color de azul oscuro a azul pálido. El escaneo UV-Vis mostró el pico de reacción para MB a 665 nm (Fig. 7a). El porcentaje de degradación observado bajo irradiación de luz visible fue del 94% después de 90 minutos (Fig. 7b) y se calculó mediante el valor porcentual de adsorción correspondiente utilizando la ecuación dada por Kwon et al.76. Sinha y Ahmaruzzaman.77 informaron que las CuONP (10 mg/L) sintetizadas a partir de un extracto acuoso de escamas de L. rohita degradaban el 96 % del colorante MB en 135 minutos y las CuONP (50 mg/L) sintetizadas a partir del alga parda Cystoseira trinodis degradaban el 89 % de Tinte MB en 210 min11. Las CuONP biogénicas (20 mg/L) sintetizadas a partir de extractos de plantas de extracto de hoja de Mussaenda frondosa exhibieron un 97 % de degradación de MB en 140 min54 y las CuONP (10 mg/L) de extracto celular de Cardiospermum halicacabum exhibieron una degradación de 93 % en 210 min55. Las CuONP (0,2 g/L) sintetizadas a partir del extracto vegetal de Achillea millefolium3 degradaron el 96 % del colorante MB en 120 min. Es necesario determinar qué especies reactivas juegan un papel mayor en el proceso de degradación fotocatalítica. Las CuONP biosintetizadas (20 mg) utilizando extracto de hoja de Psidium guajava mostraron una degradación del 89 % del colorante MB en 150 min57.

Las CuONP indujeron radicales libres durante la fotodegradación del tinte y mostraron que, en presencia de t-BuOH (eliminador de OH), la tasa de degradación del tinte MB se redujo como máximo hasta un 65% (Fig. S4). Sharma y Dutta78 también informaron que los radicales hidroxilo eran las especies reactivas de oxígeno más importantes en la degradación del tinte mediante una prueba específica de eliminación de ROS utilizando alcohol isopropílico como eliminador de radicales ·OH. Después de establecer el papel fotocatalítico de las CuONP midiendo el porcentaje de degradación del colorante MB, se prestó atención al estudio cinético. Las gráficas de las líneas de mejor ajuste de ln (C0/Ct) versus el tiempo se trazaron utilizando la concentración inicial del tinte MB (25 mg/L) y la carga variable del fotocatalizador (Fig. 7c, d) que exhibió la naturaleza lineal de nuestros datos y Confirmó que la fotodegradación del tinte MB encaja bien con el modelo cinético de reacción de pseudo primer orden. La mayor tasa de degradación fotocatalítica de las CuONP biosintetizadas puede deberse a su menor tamaño de partícula (20,7 nm, análisis TEM). Además, esto puede atribuirse a la mayor densidad de sitios deficientes en electrones generados durante la síntesis que pueden atrapar electrones fotogenerados y reducir las recombinaciones, mejorando así la actividad fotocatalítica77. El mecanismo probable para la actividad fotocatalítica de las CuONP se basa en la interacción con una fuente de luz, es decir, asociado con la absorción de fotones y la conectividad entre la reactividad de la superficie y la formación de radicales superficiales entre (H2O, O2)3. El mecanismo fotocatalítico se inició cuando los fotones fueron absorbidos por las CuONP, se fotoexcitaron y sufrieron desintegración plasmónica. Según Ghareib et al.79, la reacción completa que se produjo durante la degradación fotocatalítica del colorante MB por CuONP se puede resumir de la siguiente manera:

Los electrones o huecos generados debido a la desintegración plasmónica reaccionan con las moléculas de O2 y H2O para generar especies activas; radical superóxido aniónico (O2−.) y radical hidroxilo (OH.), respectivamente. Además, el radical hidroperoxilo (HO2) obtenido por la protonación del radical ion superóxido (O2-) se convierte en H2O2, que inevitablemente se disocia en radicales hidroxilo (OH) altamente reactivos. Aquí, en este proceso, las CuONP desempeñan un papel importante como portadores de electrones. La mayor eficiencia de degradación de las CuONP se puede atribuir a los agentes reductores presentes en el extracto de algas que promueven la formación de especies de oxígeno (por ejemplo, superóxido y radical hidroxilo) tras la irradiación 11. Una fotodegradación tan eficiente proporciona un camino conveniente para el tratamiento de tintes. bajo irradiación de luz visible.

En resumen, el presente estudio enfatiza un protocolo rentable, ambientalmente benigno y bioinspirado para la síntesis de CuONP seguido de sus aplicaciones biomédicas y fotocatalíticas. Los fitoquímicos presentes en el extracto de células de Phormidium de cianobacteria actúan como biorreductores de iones Cu2+ y como agentes estabilizadores para la biosíntesis de CuONP. Se sintetizaron con éxito CuONP de forma esférica, pequeñas (20,7 nm), de color marrón oscuro y de alta pureza (96%). En cuanto a sus aplicaciones biomédicas, las CuONP biogénicas demostraron su excelente eficacia en la eliminación de radicales libres y exhibieron una pronunciada toxicidad contra cepas microbianas patógenas con un alto grado de interacciones sinérgicas. Los resultados de citotoxicidad sugirieron el uso terapéutico de las CuONP en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y cáncer de pulmón humano. Además, las CuONP demostraron su utilización conveniente para la degradación fotocatalítica eficiente del colorante cancerígeno azul de metileno que representa una grave amenaza para la salud humana. Sin embargo, para las aplicaciones biomédicas avanzadas de CuONP, aún se requiere una investigación más extensa para reducir su toxicidad y al mismo tiempo mejorar su eficiencia biológica. Las aplicaciones de CuONP en el campo de los sensores, el envasado de alimentos y la acción antimicrobiana darán lugar a aplicaciones futuras teniendo en cuenta los aspectos de seguridad como una preocupación seria. Los hallazgos del presente estudio pueden ampliar las perspectivas para la síntesis biogénica de CuONP y su uso en una variedad de aplicaciones biomédicas y biotecnológicas.

Los productos químicos de calidad analítica utilizados se adquirieron en Sigma-Aldrich (India) o Merck (India). Todos los medios de cultivo se adquirieron en Hi Media (India). Todos los tampones y reactivos utilizados se prepararon en agua bidestilada (DDW). La cristalería se lavó minuciosamente y se secó al aire antes de su uso.

Cepa de cianobacteria Phormidium sp. (NCCU-104) se adquirió de IARI, Nueva Delhi, India. El cultivo axénico se cultivó de forma rutinaria en medio líquido BG-11 en una sala de cultivo a 30 ± 2 °C y se iluminó con lámparas fluorescentes Sylvania T12 de 40 W de color blanco frío con una intensidad de lux de 2000 ± 200 durante ciclos de luz/oscuridad de 12 h80. Se recolectaron cianobacterias en la fase de crecimiento exponencial medio para la preparación del extracto. Para el estudio antibacteriano, se recibieron Klebsiella pneumoniae (KJ 938546), Staphylococcus aureus (MCC 2708), Bacillus cereus (MCC 2243) y Escherichia coli (MCC 2052) de la colección de cultivos microbianos del Centro Nacional de Ciencia Celular (NCCS). Pune, India. Se obtuvieron aislados clínicos de Candida albicans (MCC 1151) y Candida glabrata (MCC 1432) de la Colección Nacional de Cultivos de Hongos de la India (NFCCI), Pune, India. Para el estudio anticancerígeno, se obtuvieron A549 y H1299 (líneas celulares de NSCLC humano) del Centro Nacional de Ciencia Celular (NCCS) Pune, India, y se mantuvieron en DMEM (Cat # 10569010, Gibco, Waltham, MA, EE. UU.) y se incubaron a 37 °C. y una atmósfera de 5% de CO2.

Los sedimentos de biomasa completamente lavados se suspendieron en 100 ml de agua esterilizada y se sonicaron en un Branson Sonifier 450 (Branson Ultrasonics Corp., EE. UU.) durante 3 a 5 minutos a máxima producción y ciclos de trabajo para garantizar la rotura completa de las células. Si el extracto mostraba la presencia de filamentos/células, se repetían los pasos de sonicación. Los extractos resultantes se centrifugaron a 10.000 g durante 30 minutos, se filtraron a través de papel de filtro Whatman No. 1 y se almacenaron en refrigerador a 4 °C para su uso posterior como extracto celular18. El perfil químico del extracto de cianobacterias se analizó mediante GC-MS para descubrir los compuestos probables que tienen potencial reductor y ayudan a la síntesis de nanopartículas. Las muestras para el análisis GC-MS se prepararon disolviendo el extracto seco en metanol. El análisis GC-MS se realizó con el equipo Shimadzu GC-MS QP 2010 Plus en modo de ionización electrónica (EI) equipado con una columna capilar RTX-5 (60 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Se utilizó helio como gas portador con un caudal de 0,7 ml min–1. La temperatura del inyector se fijó en 260 °C. La temperatura inicial y final de la columna fue de 80 °C y 280 °C a razón de 10 °C min–1 y 15 °C min–1 respectivamente. Se utilizó un retraso de disolvente de 3,5 minutos. Los espectros de masas se registraron en modo de exploración en el rango de 40 a 650 m/z. Los compuestos se identificaron comparándolos con la biblioteca NIST11/WILEY81.

Para la síntesis extracelular de CuONP, en 10 ml de extracto de algas, se agregaron 90 ml de solución de sulfato de cobre (0,1 M). Junto con esto, el extracto de algas (sin sulfato de cobre) y la solución de sulfato de cobre sola se tomaron por separado en dos matraces para que sirvieran como controles positivos y negativos. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación vigorosa a 90 °C, con la adición gradual de 5 ml de (NaOH) 0,1 M, la solución de color azul intenso se volvió gradualmente a una coloración rojo ladrillo que cambió a oscura después de agitación vigorosa durante 3 h. El producto sólido negro obtenido se centrifugó tres veces a 15.000 rpm durante 20 minutos después de lavarlo minuciosamente con agua destilada y etanol al 90% sucesivamente para eliminar cualquier impureza. El precipitado sólido resultante se secó en horno, se trituró hasta convertirlo en polvo y se almacenó en un recipiente hermético para su posterior análisis48,49. Las CuONP biosintetizadas se analizaron mediante espectrofotómetro UV-Vis en un rango de 200 a 500 nm (Labtronics LT 2900).

Las CuONP biosintetizadas se caracterizaron por sus propiedades fisicoquímicas con la ayuda de diferentes técnicas físicas como espectroscopia UV-Vis, espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), difracción de rayos X (XRD) y dispersión dinámica de la luz (DLS), microscopía electrónica de barrido (SEM). ) con EDX, microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) y análisis de potencial Zeta. Las CuONP biosintetizadas se analizaron utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de doble haz (Labtronics LT 2900). La suspensión de CuONP se centrifugó a 10.000 rpm/15 min y el análisis de la muestra secada al aire se registró en el espectrofotómetro FT-IR (Perkin Elmer, EE. UU.) en el rango de 500 a 4000 cm-1 con una resolución de 4 cm-182. Se registró XRD (difractómetro de rayos X Rigaku, Ultima IV, Japón) de CuONP en 2θ en el rango de 20° a 80° a 40 kV/30 mA con radiación CuKa (k = 1,54056°A), y el diámetro del dominio cristalino de CuONP se calculó a partir de los picos de XRD mediante la ecuación de Debye-Scherrer:

donde, D es el diámetro del dominio cristalino de ZnONP, "λ" es la longitud de onda de la fuente de rayos X utilizada (0,1541) y "β" es el ancho total a la mitad del máximo (FWHM) del pico de difracción y "θ" es el ángulo de Bragg. Se utilizó Dynamic Light Scattering (DLS) (Malvern, Reino Unido) para determinar el tamaño hidrodinámico y la polidispersidad de las nanopartículas. Las distribuciones de tamaño de las CuONP sintetizadas se midieron utilizando un sistema Nano Zetasizer (Zeta sizer, Malvern, Reino Unido). Antes de medir, la muestra se pasó a través de una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,2 μm con los parámetros utilizados como temperatura de medición (25 °C), viscosidad del medio e índice de refracción del material (1,59)18. El tamaño de las CuONP se determinó mediante SEM (Carl Zeiss, EE. UU.) equipado con EDS y TEM. Para el análisis SEM (Sigma versión 5.05 Zeiss, EE. UU.), se prepararon películas delgadas de CuONP dejando caer una cantidad extremadamente pequeña de la muestra sobre la oblea de silicio a un voltaje de aceleración de 20 kV con un tiempo que oscilaba entre 60 y 100 s82,83. Se utilizó el instrumento científico modelo Sirius SD (el SEM equipado con espectrómetro EDX) para determinar el análisis elemental de las CuONP. El análisis TEM se realizó en (Philips EM-410LS, JEOL, Japón) utilizando 10 μl de la solución de CuONP mantenida en las rejillas de cobre recubiertas de carbono, formando una película delgada sobre la rejilla y guardada en una caja de rejilla, secuencialmente82. Una parte seleccionada de las imágenes se observó utilizando la Imagen J y se evaluó para obtener el histograma de distribución de tamaño. La topología de la superficie de las NP de ZnO sintetizadas se obtuvo mediante análisis AFM. Se depositó una fina película de CuONP sobre una placa de vidrio de sílice dejando caer unas gotas de la solución de CuONP en la placa y luego se dejó secar a 30 °C durante la noche. Las imágenes fueron tomadas con AFM (Modelo Ntegra Prima AFM, NT-MDT, Rusia).

Se adoptaron protocolos estándar para determinar la actividad antioxidante como; Ácido 2,2′-azino-bis 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS)84, 2,2′-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)85, peróxido de hidrógeno (H2O2)86 y eliminación de radicales superóxido (SOR) ensayos87. Estos métodos se basan en la inhibición de los radicales libres, que varían mucho según la generación de radicales libres, su reproducibilidad y el criterio de valoración. Además, se comparó su potencial con el del ácido ascórbico estándar. Se sonicaron suspensiones de CuONP para evitar la aglomeración de NP (detalles en la Sección S1 de ESI). La absorbancia se midió espectrofotométricamente frente a las correspondientes soluciones en blanco y el porcentaje de inhibición de la eliminación de radicales libres se calculó utilizando la siguiente ecuación 18.

donde donde Ac = Absorbancia del control, At = Absorbancia de la prueba. Los valores de CI50 de CuONP se calcularon y compararon con el ácido ascórbico estándar.

Para evaluar la eficacia antibacteriana de las CuONP sintetizadas biológicamente, se realizó el método de microdilución en caldo recomendado por CLSI88 contra bacterias Gram negativas (Escherichia coli, Klebsiella pneumonia) y Gram positivas (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus). También se determinó la actividad antifúngica contra Candida albicans y Candida glabrata siguiendo las pautas estándar del CLSI89. Se colocaron diferentes concentraciones de CuONP (0,24–1000 µg ml-1), estreptomicina y fluconazol como control positivo en una placa de 96 pocillos en un volumen final de 100 µl. Se recogieron los patógenos de prueba y se evaluó su turbidez según el estándar McFarland 0,5. Luego, se colocaron 100 µl de cultivos celulares (aproximadamente 2,5 × 103 células por ml) en la placa de microtitulación de 96 pocillos (Tarson) y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Después de la incubación, se registró el crecimiento/turbidez a 600 nm utilizando un espectrofotómetro18. La concentración más baja de CuONP en la que no se produjo ningún crecimiento visible representó su valor MIC (Concentración mínima inhibidora). Todos los experimentos se realizaron simultáneamente por triplicado.

Las actividades sinérgicas antimicrobianas de las CuONP en combinación con los antibióticos/fungicidas estándar se evaluaron mediante el ensayo de tablero de ajedrez90. Se inoculó una placa de microtitulación con 50 µl de CuONP (0,48–125 µg ml-1) y antibióticos/fungicidas estándar (0,24–31,2 µg ml-1). Cada pocillo se inoculó con 100 µl de suspensión microbiana para completar el volumen final de 200 µl y las placas de tablero de ajedrez se incubaron durante la noche a 37 °C. Los índices de inhibición fraccional (FIC) se calcularon según la ecuación. (11).

donde la sinergia y el antagonismo fueron definidos por FICI ≤ y > 4, respectivamente. La sinergia se definió como FICI < 0,5, la sinergia parcial se definió como 0,5 < FICI < 1, mientras que la indiferencia se definió como FICI ≤ 491.

La inhibición de la desnaturalización de la albúmina se utiliza para analizar la actividad antiinflamatoria de las CuONP mediante el método modificado de Lavanya et al.92. La solución de control (0,5 ml) consta de 0,45 ml de albúmina sérica bovina (solución acuosa al 1% p/v) y 0,05 ml de agua destilada. La muestra de prueba (0,5 ml) consta de 0,45 ml de agua destilada y 0,05 ml de CuONP (25, 50, 75, 100, 125, 150 µg ml-1). La solución estándar (0,5 ml) consta de 0,45 ml de albúmina sérica bovina (solución acuosa al 1% p/v) y 0,05 ml de diversas concentraciones de diclofenaco sódico. Todas las soluciones anteriores se ajustaron a pH 6,3 usando HCl 1 N. En primer lugar, las muestras se incubaron a 37 °C durante 20 min seguido de una incubación adicional a 57 °C durante 5 min. Después de enfriar, se añadieron 2,5 ml de tampón fosfato a las soluciones preparadas anteriormente. La absorbancia se midió utilizando un espectrofotómetro UV-Visible a 416 nm. El control representa el 100% de desnaturalización de proteínas y los resultados se compararon con diclofenaco sódico y el porcentaje de inhibición de la desnaturalización de proteínas se calculó utilizando la ecuación. (12).

Biocompatibilidad de CuONP derivadas de Phormidium sp. se llevó a cabo cuantitativamente mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y cualitativamente mediante tinción con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) utilizando el método de Mossman93 y Liu et al.94. Brevemente, se sembraron 1 x 104 ml-1 de células en su fase de crecimiento exponencial en placas de 96 pocillos con medio de águila modificado por Dulbecco (DMEM) junto con suero bovino fetal (FBS) al 5% (v/v) y antibióticos al 1% y solución antimicótica. (Gibco). Se incubaron durante 24 h a 37 °C en una incubadora de humidificación con 5% de CO2. Después de la incubación, las células se trataron con diferentes concentraciones. de CuONPs (20, 40 60, 80, 100, 120 y 140 µg ml-1), se incubaron durante 24 h y se lavaron con PBS tres veces. Después de 24 h de incubación, en cada pocillo se mezcló el tinte MTT añadido (5 mg/ml) con medio completo DMEM en una proporción de 9:1 y se incubó nuevamente a 37 °C durante 3 a 4 h. Luego, se eliminó el medio y se agregaron 100 µl de DMSO en cada pocillo. Las placas se analizaron en un lector de microplacas (lector de microplacas BIO-RAD-550) a 595 nm y el porcentaje de viabilidad se calculó utilizando la ecuación. (13).

donde AC = absorbancia del control: AT = absorbancia de las células tratadas, AB = absorbancia del blanco. Se determinaron los valores de CI50 de CuONP para cada línea celular.

Las células se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) fluorescente para detectar condensación nuclear y formación de burbujas. Después de 48 h de tratamiento, las células en una placa de 12 pocillos se lavaron con PBS tres veces. Luego, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 8 minutos y luego se lavaron con PBS tres veces. Después de eso, las células se permeabilizaron tratándolas con Triton X-100 al 0,1% durante 2 minutos. Se lavó nuevamente 3 veces con PBS y se trató con colorante fluorescente DAPI 1 μg/ml. Después de 5 minutos, se añadió PBS al pocillo para mantener las células hidratadas mientras se obtenían imágenes con un microscopio fluorescente ZOE Fluorescent Cell Imager, (Bio-Rad)17.

Las CuONP derivadas de Phormidium sp. También se evaluaron la degradación del colorante azul de metileno (MB). Para ello, se añadieron 5, 10, 15, 20 y 25 mg/l de CuONP a 100 ml de solución acuosa que contenía 25 mg/l de colorante MB. Antes de la irradiación (lámpara de xenón de 500 W), las suspensiones se agitaron magnéticamente durante 1 h en la oscuridad para alcanzar un equilibrio de adsorción/desorción entre las CuONP y la solución de tinte. Las mezclas de suspensión se retiraron a intervalos regulares y se centrifugaron. Para determinar la concentración de tinte restante, los espectros de absorción se registraron a 665 nm para (MB) utilizando un espectrofotómetro UV-Vis77. A otro conjunto (control) se le permitió reaccionar en condiciones idénticas sin CuONP (fotocatalizador). El porcentaje de eficiencia de degradación para la reacción fotocatalítica se calculó utilizando la ecuación. (14).

donde A0 y A son la absorbancia inicial y final del tinte MB en λmax, respectivamente.

Se adoptaron protocolos específicos de eliminación de radicales libres para identificar su papel en la degradación del azul de metileno por las CuONP. Se añadieron diferentes eliminadores a la mezcla de reacción, a saber. oxalato de amonio (eliminador de h+), p-benzoquinona (eliminador de O2−) y terc-butanol (eliminador de OH)95. Se colocaron CuONP (10 mg/l) y eliminadores de radicales (10 mM) en 100 ml de solución de colorante de 25 mg/l junto con los respectivos eliminadores. Las mezclas de reacción se colocaron bajo la luz del sol durante 1 h. Finalmente se calculó la tasa de degradación del tinte para determinar el papel activo de las especies carroñeras.

El análisis de los datos se realizó utilizando el software estadístico estándar Origin 8.1. Se utilizaron medidas estadísticas descriptivas, especialmente la media y la desviación estándar, para resumir la recopilación de datos para cada medición. Se utilizó un análisis de varianza bidireccional para evaluar la influencia de variables independientes así como las posibles interacciones entre ellas en el estudio de la actividad antibacteriana y antioxidante. Se consideraron estadísticamente significativos valores de *p < 0,05. Cada prueba se realizó por triplicado y los resultados se presentaron como media ± DE.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Los autores agradecen a la Comisión de Becas Universitarias de la India por brindar el apoyo financiero necesario para llevar a cabo este trabajo de investigación. Los autores agradecen al Centro de Nanociencia y Nanotecnología (CNN), JMI (Nueva Delhi) por las instalaciones analíticas y al Instituto Indio de Investigación Agrícola (IARI, Delhi) por proporcionar una cepa de cianobacterias (Phormidium sp.). Los autores agradecen a DIF-Biosciences, JMI y CIF-CIRBSc, JMI, Nueva Delhi por proporcionar instrumentos analíticos en el presente estudio.

Departamento de Biociencias, Jamia Millia Islamia, Jamia Nagar, Nueva Delhi, 110025, India

Nida Asif, Rakhshan Ahmad, Samreen Fatima, Shehzadi Shehzadi, Tabassum Siddiqui y Tasneem Fatma

Departamento de Biotecnología, Jamia Millia Islamia, Nueva Delhi, 110025, India

Almaz Zaki

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NA: Investigación, Metodología, Análisis formal, Análisis de datos, Escritura: borrador original, Visualización. RA: Análisis de datos. SF: Formateo y edición SS: Metodología. TS: Preparar datos complementarios, AZ: Realizó actividad anticancerígena. TF: Conceptualización, Recursos, Supervisión, Curación de datos, Redacción: revisión y edición final. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Tasneem Fatma.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Asif, N., Ahmad, R., Fátima, S. et al. Evaluación toxicológica de Phormidium sp. nanopartículas derivadas de óxido de cobre para sus aplicaciones biomédicas y ambientales. Representante científico 13, 6246 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33360-3

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Recibido: 02 de noviembre de 2022

Aceptado: 12 de abril de 2023

Publicado: 17 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33360-3

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