Respuesta fisiológica y análisis proteómico de Reaumuria Soongorica bajo estrés salino.

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Jun 19, 2023

Respuesta fisiológica y análisis proteómico de Reaumuria Soongorica bajo estrés salino.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 2539 (2022) Cite este artículo 2676 Accesos 6 Citas 1 Detalles de Altmetric Metrics Se publicó una corrección del autor de este artículo el 19 de diciembre de 2022

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La salinidad del suelo puede restringir gravemente el crecimiento de las plantas. Sin embargo, Reaumuria Soongorica puede tolerar bien la salinidad. Sin embargo, aún no se han informado estudios proteómicos a gran escala sobre la respuesta de esta planta a la salinidad. En este caso, se utilizaron plántulas de R. Soongorica (de 4 meses de edad) en un experimento en el que soluciones de NaCl simularon niveles de estrés por salinidad del suelo. Se determinaron el peso fresco, la relación raíz/brote, la conductividad relativa de la hoja, el contenido de prolina y el área foliar total de R. Soongorica bajo estrés salino CK (0 mM NaCl), bajo (200 mM NaCl) y alto (500 mM NaCl). . Los resultados mostraron que el contenido de prolina de las hojas se correlacionaba positivamente con la concentración de sal. Con mayor salinidad, el peso fresco de la planta, la relación raíz/brote y el área foliar total aumentaron inicialmente pero luego disminuyeron, y viceversa para la conductividad eléctrica relativa de las hojas. Utilizando la secuenciación proteómica iTRAQ, se identificaron 47.177.136 proteínas expresadas diferencialmente (DEP) en comparaciones con bajo contenido de sal versus CK, alto contenido de sal versus control y alto contenido de sal versus bajo contenido de sal, respectivamente. Se examinaron adicionalmente un total de 72 DEP de los grupos de comparación, de los cuales 34 DEP aumentaron y 38 DEP disminuyeron en abundancia. Estos DEP participan principalmente en la traducción, la estructura ribosómica y la biogénesis. Finalmente, se identificaron 21 DEP clave (valor SCORE ≥ 60 puntos) como objetivos potenciales para la tolerancia a la sal de R. Soongolica. Al comparar la estructura proteica de las hojas tratadas con las de CK bajo estrés salino, revelamos los genes candidatos clave que sustentan la capacidad de tolerancia a la sal de R. Soongolica. Este trabajo proporciona una nueva visión de su estrategia de adaptación fisiológica y su red reguladora molecular, y una base molecular para mejorar su reproducción en condiciones de estrés salino.

La salinización del suelo es uno de los principales factores ambientales que limitan el desarrollo sostenible de la agricultura y la silvicultura en todo el mundo1. La salinización perjudica el potencial productivo del suelo, destruye el hábitat de las plantas, reduce la diversidad de las comunidades y altera la cadena ecológica, lo que conduce a la degradación o pérdida de las funciones de los ecosistemas. Según estadísticas recientes, la superficie total de tierras salinas-álcalis a nivel mundial ha alcanzado los 954 millones de hectáreas, con una tasa de expansión anual del 10%2,3. Están especialmente en riesgo las zonas áridas y semiáridas, donde las condiciones climáticas caracterizadas por escasas precipitaciones y una fuerte evaporación favorecen aún más la acumulación de sal en la superficie del suelo. Por lo tanto, es imperativo que los investigadores cultiven nuevas variedades de plantas tolerantes a la sal y utilicen más plantas tolerantes a la sal en el cultivo regional.

Para hacer frente a la toxicidad iónica y al estrés osmótico causado por el estrés salino, las plantas han desarrollado un conjunto de mecanismos adaptativos para minimizar dicho daño a las células y tejidos4. Estos consisten principalmente en adaptaciones morfológicas5, regulación de sustancias osmóticas6, funcionamiento defensivo del sistema enzimático antioxidante7, cambios en la vía de fotorrespiración8 y aislamiento de la zona iónica en las células9. Además, algunas plantas secretoras de sal pueden formar glándulas de sal y utilizarlas o vesículas para secretar el exceso de sal fuera del cuerpo y evitar una gran acumulación de iones de sal10. En los últimos años, con los rápidos avances en la tecnología proteómica, el enfoque proteómico ha proporcionado un atajo poderoso para predecir la respuesta de las plantas a las condiciones de estrés salino. El uso de tecnología proteómica para revelar diferencias en la expresión de proteínas de plantas sometidas a estrés salino es ahora un punto de investigación en la era posgenómica. Estudios anteriores han analizado la composición proteica y el cambio de las estructuras celulares y subcelulares en diferentes tejidos y órganos de plantas sometidas a estrés salino, como en Lobular11, okra12, arroz13, alfalfa14 y regaliz15, descubriendo así muchas proteínas reactivas a la sal que confieren estrés salino. rasgos de resistencia. Estos incluyen acuaporinas, proteínas ribosómicas, proteínas quinasas de choque térmico, ornitina descarboxilasa, ascorbato peroxidasa y algunos factores de transcripción; otro estudio muestra que las proteínas relacionadas con la síntesis de alcaloides podrían desempeñar un papel importante en la producción de metabolitos secundarios de las plantas16.

Reaumuria Soongorica es un típico arbusto halófilo perenne que produce sal, que muestra una gran adaptabilidad a suelos salinos y desérticos, y es una especie dominante representativa en áreas desérticas salinas y alcalinas de ecosistemas de pastizales. Esta especie desempeña un papel crucial en la estabilización de las arenas movedizas, ayudando así a prevenir la erosión del suelo y la desertificación17. Además, la comunidad de R. Soongorica proporciona buenos pastos en zonas desérticas18, con excelentes efectos de mejora del suelo19. Por lo tanto, esta especie de planta ofrece un material ideal para estudiar y analizar las respuestas fisiológicas y el mecanismo de regulación molecular que sustenta la tolerancia a la sal. Hasta la fecha, los estudios sobre la tolerancia a la sal de R. Soongorica se han centrado principalmente en sus índices fisiológicos y bioquímicos, como la absorción de iones, la germinación de las semillas y la capacidad antioxidante del callo17,20,21, sin informes aún sobre los efectos del estrés salino en su proteómica. En este estudio, se utilizó NaCl para imponer un tratamiento de estrés salino y se realizó un experimento de simulación de sal en el suelo para medir los índices fisiológicos de las plántulas de R. Soongorica. Mientras tanto, se utilizó tecnología sin etiquetas para estudiar los efectos del estrés salino en los tipos y la variación de proteínas expresadas diferencialmente en plántulas de R. Soongorica, con el objetivo de extraer aquellas proteínas relacionadas con el estrés salino. Aclarar las rutas metabólicas relacionadas involucradas en el proceso de tolerancia a la sal de R. Soongorica puede proporcionar pistas importantes para dilucidar aún más los mecanismos de respuesta fisiológica y molecular de las plantas de R. Soongorica a las condiciones de estrés salino, y esto debería proporcionar una base científica más efectiva para el mejoramiento genético. Rasgos tolerantes a la sal en R. Soongorica.

Como se muestra en la Tabla 1, en comparación con el control A (es decir, NaCl 0 mM), tanto el peso fresco como la relación raíz/brote de R. Soongorica en el grupo B (es decir, NaCl 200 mM) fueron significativamente mayores. Sin embargo, tanto el peso fresco como la relación raíz/brote disminuyeron gradualmente en el grupo C (es decir, NaCl 500 mM). Cuando la concentración de NaCl alcanzó la del grupo C (es decir, NaCl 500 mM), el crecimiento de R. Soongorica se inhibió significativamente. El peso fresco de los tejidos aéreos y radiculares fue respectivamente 43,82% y 50,99% del control, y estas diferencias fueron significativas (P <0,05). Bajo el tratamiento con NaCl con la concentración de B, el contenido de agua de los tejidos aéreos y de las raíces, así como el área foliar total de las hojas, excedieron al del control. Sin embargo, cuando la concentración de NaCl era C, el contenido de agua de los tejidos aéreos y de las raíces fue significativamente menor que el del control.

Bajo estrés salino, la Fig. 1-I muestra los cambios sensibles en la conductividad relativa y el contenido de prolina de las hojas de R. Soongorica. La conductividad relativa disminuyó al principio y luego aumentó al aumentar la concentración de estrés de NaCl, y las diferencias fueron estadísticamente significativas. Mientras tanto, el contenido de prolina en las hojas también aumentó significativamente (Fig. 1-II). Estos resultados indicaron que R. Soongorica podría adaptarse a un ambiente de estrés salino ajustando su contenido de prolina a nivel de hojas. En condiciones de estrés salino bajo, el sistema de membrana celular de las hojas de R. Soongorica no resultó dañado por el estrés, y su membrana celular tenía una gran estabilidad y podía adaptarse adecuadamente a un determinado ambiente salino.

Efectos de las concentraciones de NaCl sobre la conductividad relativa y el contenido de prolina de las hojas de R. Soongorica. I: conductividad relativa II: contenido de prolina.

Número de proteínas expresadas diferencialmente (DEP) y su análisis del diagrama de Venn. Nota: A vs. B denota B comparado con A; Asimismo, A vs. C denota C en comparación con A, y B vs. C es C en comparación con B. Lo mismo ocurre con las figuras siguientes.

Análisis de agrupamiento jerárquico para proteínas expresadas diferencialmente bajo estrés salino. Nota: El sombreado azul refleja el grado de disminución de la expresión de proteínas, mientras que el sombreado rojo refleja el grado de aumento de la expresión de proteínas.

Clasificaciones funcionales de proteínas expresadas diferencialmente. Nota: respectivamente. A: procesamiento y modificación de ARN; B: estructura y dinámica de la cromatina; C: Producción y conversión de energía; E: Transporte y metabolismo de aminoácidos; F: Transporte y metabolismo de nucleótidos; G: Transporte y metabolismo de carbohidratos; H: Transporte y metabolismo de coenzimas; I: Transporte y metabolismo de lípidos; J: Traducción, estructura ribosómica y biogénesis; K: Transcripción; L: Replicación, recombinación y reparación; M: biogénesis de pared celular/membrana/envoltura; O: modificación postraduccional, recambio proteico, acompañantes; P: Transporte y metabolismo de iones inorgánicos; P: Biosíntesis, transporte y catabolismo de metabolitos secundarios; R: Sólo predicción de función general; S: Función desconocida; T: Mecanismos de transducción de señales; U: tráfico, secreción y transporte vesicular intracelular; V: Mecanismos de defensa; Z: Citoesqueleto;

Anotación de ontología genética (GO) de proteínas expresadas diferencialmente bajo estrés salino. Nota: Los resultados de enriquecimiento para las tres categorías se muestran en la figura, con hasta 20 elementos para cada una.

Diagramas de barras de los resultados del enriquecimiento KEGG de las proteínas diferenciales.

Diagrama de red de interacción de proteínas. Nota: Los círculos de "nodos" representan proteínas. Diferentes colores indican diferentes proteínas. La línea recta muestra la interacción entre proteínas; cuanto más gruesa es la línea, más fuerte es la interacción.

En comparación con el grupo A, se obtuvieron 47 DEP del grupo B, de las cuales 36 proteínas estaban reguladas positivamente y 11 proteínas estaban reguladas negativamente. En comparación con el grupo A, se obtuvieron 177 DEP del grupo C, 126 de ellas reguladas positivamente y las otras 51 proteínas reguladas negativamente. En comparación con el grupo B, se obtuvieron 136 DEP del grupo C: 67 y 69 que estaban regulados hacia arriba y hacia abajo, respectivamente (Fig. 2-I). Las proteínas identificadas con expresiones significativamente diferentes se analizaron estadísticamente y se encontró que una cierta cantidad de proteínas eran comunes entre los tres grupos, como se muestra en la Fig. 2-II. Evidentemente, aparecieron diferentes proteínas en los tres grupos, y hubo 12, 83 y 65 proteínas específicas en los grupos de comparación A vs. B, A vs. C y B vs. C, respectivamente. En los grupos A versus B y A versus C, se encontraron 31 sitios de proteínas diferenciales. Entre estos, 27 sitios de proteínas diferenciales estaban regulados positivamente y 4 estaban regulados negativamente. En los grupos A versus B y B versus C, hubo 8 sitios de proteínas diferenciales, 3 regulados positivamente y 1 regulado negativamente, mientras que los otros cuatro DEP mostraron patrones de expresión opuestos en los dos grupos de comparación. Hubo 67 sitios de proteínas diferenciales en los grupos A frente a C y B frente a C: 37 estaban regulados positivamente y 30 regulados negativamente. Estos resultados indicaron que se produjeron diferencias significativas en la expresión de proteínas entre condiciones bajas en sal (B) y altas en sal (C) en plántulas de R. Soongorica. En particular, 83 proteínas solo se expresaron en A frente a C bajo estrés salino elevado, y este número superó significativamente el de otros grupos de comparación. Esto puede indicar la autoprotección de las plantas sometidas a un alto estrés salino al iniciar mayores niveles de expresión genética.

Como se ve en la Fig. 3, cada columna del gráfico representa una muestra y cada fila representa una proteína; El color representa el nivel de expresión relativo de una proteína determinada en el grupo de muestras. A la izquierda está el árbol de agrupación de proteínas: cuanto más cercanas están las ramas de dos proteínas, más cercanos son sus niveles de expresión, es decir, más cercanas son las tendencias en su variación. Al analizar la regulación positiva y negativa de diferentes proteínas en diferentes grupos de muestras, podemos decir que la similitud entre las tres muestras repetidas en cada grupo es muy alta, lo que respaldaría la detección de las DEP en consecuencia.

La Figura 4 muestra que bajo la respuesta al estrés salino, los DEP participan en diferentes procesos biológicos. Estos incluyeron el procesamiento y modificación del ARN, la estructura y dinámica de la cromatina, la producción y conversión de energía, el transporte de aminoácidos, el transporte de nucleótidos y el metabolismo, entre otros. Hubo 29 proteínas diferenciales en el grupo de comparación A versus B que podrían anotarse y clasificarse funcionalmente mediante la base de datos COG. Estas proteínas diferenciales estuvieron involucradas principalmente en la traducción, la estructura ribosómica y la biogénesis, la función desconocida, la modificación postraduccional, el recambio de proteínas y el proceso biológico de las chaperonas, de las cuales 21 estaban reguladas al alza y 8 a la baja. En el grupo de comparación A versus C, 112 proteínas diferenciales fueron anotadas y clasificadas funcionalmente por la base de datos COG, estas involucradas principalmente en la traducción, estructura ribosómica y biogénesis, función desconocida, predicción de función general únicamente, proceso biológico de producción y conversión de energía, de las cuales 78 y 34 respectivamente estaban regulados al alza y a la baja. Se encontraron 86 proteínas diferenciales en el grupo de comparación B frente a C que podrían anotarse y clasificarse funcionalmente mediante la base de datos COG. Estuvieron principalmente involucrados en la traducción, la estructura ribosomal y la biogénesis, la predicción de la función general únicamente, la modificación postraduccional, el recambio de proteínas y el proceso biológico de las chaperonas, con 35 regulados positivamente y 51 regulados negativamente.

Después de su anotación GO, las proteínas diferenciales se clasificaron según las categorías funcionales de función molecular (MF), componente celular (CC) y proceso biológico (BP). Las principales funciones biológicas realizadas por el DEPS podrían determinarse mediante un análisis de importancia de GO. En el análisis del grupo de control A versus B, se obtuvieron 276 elementos GO (P <0,05), que constan de 194 elementos BP, 31 elementos CC y 51 elementos MF, con 14 proteínas diferenciales anotadas por GO. Estos DEP se enriquecieron principalmente en traducción, respuesta al estímulo externo, estructura intracelular, ribosoma y constituyente estructural del ribosoma, y ​​proceso metabólico, etc. En el análisis del grupo de control A versus C, se obtuvieron 495 elementos GO (P <0,05). a saber, 274 elementos de BP, 88 elementos de CC y 133 elementos de MF, con 82 proteínas diferenciales anotadas por GO. Estos DEP se enriquecieron principalmente en traducción, proceso biosintético, ribosoma, membrana, constituyente estructural del ribosoma, actividad oxidorreductasa y de otras maneras. En el análisis del grupo de control B versus C, se obtuvieron 390 elementos GO (P <0,05), que comprenden 213 elementos BP, 78 elementos CC y 99 elementos MF, con 50 proteínas diferenciales anotadas por GO. Estos DEP se enriquecieron principalmente en traducción, fotosíntesis, citoplasma, subunidad ribosomal pequeña, constituyente estructural del ribosoma y unión de ARN, etc. (Fig. 5).

Ante el estrés salino, el funcionamiento de las proteínas depende de la acción sinérgica de múltiples proteínas, lo que resulta en cambios significativos en términos de su abundancia. El análisis de rutas puede proporcionar una comprensión más completa y sistemática del proceso biológico para el que cada proteína es relevante y, por lo tanto, señalar y revelar la red metabólica del estrés salino. Para comprender mejor las funciones biológicas de los DEP descubiertos, se realizó su análisis de enriquecimiento KEGG. Estos resultados mostraron que (Fig. 6) en el grupo de comparación A versus B, las proteínas diferenciales se enriquecieron significativamente (P <0,05) en seis vías metabólicas (biosíntesis de sesquiterpenoides y triterpenoides, biosíntesis de glucosinolatos, interacción planta-patógeno, ribosomas, etc. ). Las proteínas diferenciales del grupo de comparación A frente a C se enriquecieron significativamente en 16 vías metabólicas (metabolismo del ácido linoleico, metabolismo del ácido dibásico C5, metabolismo de la porfirina y la clorofila, etc.). Finalmente, las proteínas diferenciales en el grupo de comparación B vs. C se enriquecieron significativamente en 13 vías metabólicas (biosíntesis de glucosinolatos, metabolismo del nitrógeno, interacciones SNARE en el transporte vesicular, etc.).

Investigar la función biológica y la regulación de las DEP en las hojas de R. Soongorica sometidas a estrés salino y descubrir aquellas proteínas clave relacionadas con la tolerancia a la sal. Para ello, se utilizó una puntuación compuesta de PPI (interacciones de proteínas) superior a 0,4 para determinar la red de interacción. Como muestra la Fig. 7, se identificaron cinco interacciones de histonas en el grupo de comparación A versus B, y un total de 17 DEP estuvieron involucradas en la red de interacción de proteínas de las plántulas bajo estrés salino. El RPS23B (proteína ribosomal 40S S23-2) y el RACK1C (receptor de la quinasa C activada 1C) tenían conexiones de 7 y 6 nodos, respectivamente. Las conexiones de nodos de AT5G18380 (proteína ribosomal 40S S16-3), RPL2-A (proteína ribosomal 50S L2) y EMB3010 (proteína ribosomal 40S S6-2) fueron 5 en cada caso. Para P5CR (pirrolina-5-carboxilato reductasa), NUDT3 (nudix hidrolasa 3) y RPL12-A (proteína ribosomal 60S L12), cada uno tenía 3 conexiones de nodos. En el grupo de comparación A versus C, 87 DEP estuvieron involucradas en la red de interacción de proteínas bajo estrés salino, y 18 de ellas tenían más de 10 conexiones de nodos, con la mayor cantidad de líneas de nodos obtenidas para RPS13 (proteína ribosómica 30S S13, 21). RPS10 (proteína ribosomal 30S S10, 21), RPL27 (proteína ribosomal 50S L27, 17), PPOX2 (protoporfirinógeno oxidasa 2, 17), RPL29 (proteína ribosomal 50S L29, 14) y RPL2-A (proteína ribosomal 50S L2, 14). ), etc. En el grupo de comparación B vs. C, 61 DEP participaron en la red de interacción de proteínas bajo estrés salino; 14 de ellos tenían más de 10 conexiones nodales, y la mayoría de las líneas nodales se encontraron para RPS13 (proteína ribosomal 30S S13, 20), CFBP1 (fructosa-1,6-bisfosfatasa 1, 18), RPS10 (proteína ribosomal 30S S10, 17). , RPL27 (proteína ribosomal 50S L27, 15), RPS11C (proteína ribosomal 40S S11-3, 14) y RPL5 (proteína ribosomal 50S L5, 13), etc.

Según la base de datos del COG, se pudieron anotar y clasificar funcionalmente 29, 112 y 86 DEP en los grupos de comparación A vs. B, A vs. C y B vs. C. Combinados con la red reguladora de interacción diferencial de proteínas, se seleccionaron puntos de proteínas con un número de conexión de nodo> 1 y se integraron proteínas repetidas en cada grupo de comparación para descartar aún más las 72 DEP. La abundancia de 34 DEP aumentó y 38 DEP disminuyeron bajo los tratamientos de estrés salino. Las más variadas proteínas estuvieron involucradas en la traducción, estructura ribosómica y biogénesis, ascendiendo a 20 de ellas, de las cuales 17 pertenecían a la familia de proteínas ribosómicas (RP). Seis proteínas ribosómicas (RPL2-A, RPL12A, RPS23B, RPS6B, RPL30A y RPS16C) estaban reguladas positivamente, mientras que los niveles de expresión de otras 11 (RPL5, RPS13, RPS10, RPS2D, RPS11C, RPS20B, RPL21A, RPL27, RPS9, RPL29 y RPL7AA) se regularon negativamente bajo el estrés de NaCl. Estos resultados mostraron que las plántulas de R. Soongorica podían tolerar el estrés sintetizando y degradando proteínas en respuesta a las condiciones de estrés salino. Además, también se encontraron algunas proteínas (GUN4, MRL1) con diferencias de expresión pronunciadas pero sin funciones reportadas. Estos serán investigados en trabajos futuros planificados. La puntuación de cada proteína se calculó mediante el software de búsqueda Mascot22. Si la puntuación era superior a 60, la proteína se consideraba fiable. Finalmente, se determinaron cuatro categorías de interés y se agruparon artificialmente sus DEP relacionadas: aquellas proteínas relacionadas con la energía y el metabolismo de las plantas, aquellas proteínas asociadas con la fotosíntesis, aquellas proteínas relacionadas con la defensa de las plantas y la resistencia al estrés, y aquellas que participan en la síntesis, procesamiento y procesamiento de proteínas. degradación (Tabla 2).

La salinidad es sin duda un problema que se agrava a nivel mundial, siendo un estrés abiótico importante que afecta el crecimiento, desarrollo y productividad de las plantas23. Sin embargo, existen diferencias en los mecanismos de tolerancia al estrés salino entre las diferentes especies de plantas. El estrés osmótico es una respuesta directa de las plantas al estrés salino, y las plantas pueden mitigar el daño sufrido regulando sustancias reguladoras intracelulares24,25. Además, la generación y transporte de biomasa también es un factor importante para evaluar el grado de estrés salino en las plantas26. Los estudios han demostrado que el estrés salino reduce la síntesis de biomasa vegetal y que las hojas de las plantas son capaces de responder al estrés salino mediante la rápida acumulación de prolina27,28,29. En nuestro experimento, bajo la condición de estrés de B bajo en sal (NaCl 200 mM), el peso fresco y la relación raíz/brote de las plántulas de R. Soongorica aumentaron, y el bajo contenido de sal tuvo un efecto promocional significativo en su crecimiento. Sin embargo, cuando la concentración de NaCl alcanzó C (NaCl 500 mM), el peso fresco de las plántulas y la relación raíz-brote disminuyeron, y su crecimiento se inhibió significativamente. Estos resultados, que son consistentes con los de Nasim et al.30 para el guisante mariposa, podrían explicarse por la alta tolerancia a la sal de R. Soongorica en el rango de salinidad impuesto; específicamente, al confiar efectivamente en la acumulación de Na+ y Cl- para regular la permeabilidad celular y mantener la expansión, y a través de una homeostasis efectiva del K+ para mantener el funcionamiento de los estomas en las hojas. La inhibición del crecimiento de las plántulas en condiciones de alto contenido de sal probablemente se deba a la capacidad limitada para aislar Na+ y Cl- en las vacuolas31. El contenido de prolina en las hojas de R. Soongorica aumentó significativamente con una mayor concentración de sal, un resultado consistente con los hallazgos de estudios previos, posiblemente porque el gen de síntesis de prolina se activó o la expresión del gen de degradación de prolina se inhibió bajo estrés salino28.

Es necesario para el crecimiento y desarrollo de las plantas producir energía catabólica ante la salinidad. La glucólisis y el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) son las principales vías para la producción de energía32, y el CS es una enzima clave del ciclo del TCA33. La regulación positiva de la expresión de CS puede mejorar la tolerancia del maíz al estrés salino34. Encontramos que la expresión de la proteína de la familia CS (CSY4) estaba regulada positivamente 2,35 y 3,89 veces bajo estrés bajo en sal (A vs. B) y alto en sal (A vs. C), respectivamente. La regulación positiva de la vía del TCA contribuiría a la producción de energía catabólica de R. Soongorica para respaldar el crecimiento de sus plántulas en condiciones de estrés salino. La V-ATPasa desempeña un papel clave en la activación del transporte activo secundario de las plantas y es una enzima indispensable en las plantas, especialmente para hacer frente al estrés abiótico35. Por ejemplo, se demostró que la sobreexpresión del gen de la proteína de la subunidad C vacuolar V-ATPasa aumenta la capacidad de tolerancia a la sal del tabaco36. Encontramos dos isoformas (VHA-A, VHA-E1) de V-ATPasa en hojas de R. Soongorica. Ambos estaban regulados positivamente bajo estrés salino impuesto, mientras que AHA4 estaba regulado positivamente en la membrana plasmática. Esto puede deberse a que los niveles de expresión aumentados de VHA-A, VHA-E1 y AHA4 están asociados con la captación y transporte de Ca2+ y K+, que participan en la regulación de la homeostasis de las proteínas bajo estrés salino. La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PCK1) funciona como una enzima catalítica, convirtiendo el oxalacetato (para regular la homeostasis de las proteínas bajo estrés salino) en fosfoenolpiruvato, un producto intermedio en la glucólisis37. El aumento de la expresión de esta proteína en las hojas de R. Soongorica bajo estrés salino puede estar relacionado con la capacidad de esta planta para tolerar el estrés salino.

La fotosíntesis es el proceso más importante del metabolismo vegetal38. Rubisco es una enzima clave en la reacción oscura de la fotosíntesis y desempeña un papel central en la fijación de carbono39. Bajo estrés salino, la expresión de la proteína rubisco en las hojas de Prunus mume estaba regulada a la baja40, pero su expresión en las hojas de Haloxylon salicornicum estaba regulada al alza41. Encontramos que la expresión de rubisco (RCA) estaba regulada negativamente en los grupos de comparación A vs. C y B vs. C, lo que sugiere que la expresión de rubisco regulada negativamente puede conducir a una utilización reducida de la energía luminosa en las hojas de R. Soongorica mientras están bajo estrés salino. En las plantas, PSAN es la subunidad que media la transferencia de energía LHCII al núcleo del fotosistema I (PSI) y ocupa un lugar destacado en el fomento del transporte eficiente de electrones desde la plastocianina a P700. En los organismos fotosintéticos eucariotas, la subunidad PSI PSAF participa en el acoplamiento de las proteínas donadoras de electrones plastocianina y citocromo c642; sin embargo, el estrés salino-álcali puede reducir significativamente la estabilidad de unión entre las subunidades de PSI43. En nuestro estudio, los niveles de expresión tanto de PSAN como de PSAF en R. Soongorica disminuyeron bajo estrés salino, tal vez porque el estrés salino inhibe el mecanismo de transferencia de electrones en sus hojas. El fotosistema II (PSII) es propenso a sufrir daños fotoinducidos; por lo tanto, se repara continuamente para mantener su función. La proteína Psb27 interactúa con la subunidad CP43 del PSII y participa en esta reparación del PSII, y en Arabidopsis se encontraron dos proteínas similares a PSB27 (PSB27-H1 y PSB27-H2) involucradas en la reparación del PSII44. Nuestro estudio encontró que la proteína PSB27-1 estaba regulada negativamente 0,61 y 0,65 veces en los grupos de comparación A vs. C y B vs. C, respectivamente, lo que podría explicarse por el daño tanto en el lado donante como en el lado receptor del PSII. y fotoinhibición severa tanto de PSII como de PSI. Estos resultados sugieren que estas cuatro proteínas relacionadas con la fotosíntesis pueden desempeñar papeles importantes en la respuesta de las hojas al estrés salino.

La pirrolina-5-ácido carboxílico reductasa (P5CR) es una enzima terminal que funciona de manera crítica en la biosíntesis de prolina45. Para mejorar su tolerancia a la sal, las hojas de Sorghum bicolor46 y batata47 pueden acumular grandes cantidades de prolina mediante la sobreexpresión de la proteína P5CR bajo estrés salino. En nuestro estudio, la proteína P5CR se reguló positivamente 1,51 y 3,11 veces bajo estrés salino bajo y alto, respectivamente, lo que explica aún más por qué el contenido de prolina aumentó bajo estrés salino como se muestra en la Fig. 1-II. Se ha sugerido que la prolina podría inducir la expresión de genes sensibles en respuesta al estrés fisiológico causado por demasiada salinidad. Informes anteriores han revelado que el estrés salino indujo la expresión de FC2 en hojas de Arabidopsis48. Asimismo, en R. Soongorica, el alto estrés salino provocó que el FC2 aumentara 1,68 veces. Esto muestra que en condiciones de alto contenido de sal, la expresión de la proteína FC2 puede controlar eficazmente el transporte y la distribución del metal en la célula, permitiendo que cada célula de la hoja alcance un estado de equilibrio estable, lo que demuestra una cierta tolerancia al estrés salino. Las proteínas SNARE impulsan el transporte de vesículas y el funcionamiento de la membrana de transporte, llevando la carga a sitios objetivo dentro y sobre la superficie celular, contribuyendo así a la homeostasis celular, la morfogénesis y la defensa contra patógenos49. Las proteínas SYP son una familia de proteínas QC-SNARE exclusivas de las plantas. En Arabidopsis, SYP121 interactúa con KAT1 y KC1 (canales de K) para regular las corrientes de K+ en la membrana plasmática50. Se sabe que la expresión aumentada de la proteína SlSYP51.2 mejora la tolerancia de la planta de tomate al estrés salino51. En nuestro estudio, las proteínas SYP71 y SYP131 estaban reguladas positivamente en condiciones de alta salinidad (A frente a C), lo que sugiere que estas proteínas pueden regular de manera similar la actividad de los canales de iones metálicos y, por lo tanto, mejorar la tolerancia al estrés salino de R. Soongorica.

La síntesis de ribosomas puede desencadenar la respuesta al estrés nucleolar y activar p53, manteniendo así la estabilidad del entorno intracelular52. El ribosoma consta de dos partes, el caso de la proteína ribosómica (RP) y del ARN ribosómico. El RP no sólo mantiene la configuración del ARN, sino que también participa en la síntesis, transporte y localización de proteínas53. La salinidad redujo la abundancia de la expresión de proteínas ribosómicas en el bentgrass rastrero54. Li et al.55 descubrieron que en el caso del algodón americano (upland) sometido a estrés salino, la abundancia de dos proteínas ribosómicas disminuía mientras que la de dos proteínas ribosómicas aumentaba. Nuestros datos mostraron que la abundancia de tres proteínas ribosómicas (RPL2-A, RPL12A y RPS6B) aumenta significativamente en condiciones de bajo estrés salino, lo que sugiere que el nivel general de síntesis de proteínas de las plántulas de R. Soongorica aumentó en condiciones de bajo estrés salino y promovió el crecimiento de esta planta. . Bajo estrés salino elevado, la abundancia de dos proteínas ribosómicas (RPL2-A y RPL12A) aumentó significativamente, y la abundancia de cuatro proteínas ribosómicas (RPS10, RPS2D, RPS9 y RPL7AA) disminuyó significativamente. Sin embargo, al mismo tiempo, la expresión de un factor liberador de cadena peptídica (AT2G47020) se reguló significativamente, lo que indica que el nivel general de síntesis de proteínas de las plántulas de R. Soongorica disminuye en condiciones de alto estrés salino. La regulación diferencial de diferentes proteínas ribosómicas en el mecanismo de traducción sugiere que las plántulas de R. Soongorica hacen frente al alto estrés salino equilibrando la síntesis y degradación de las proteínas ribosómicas.

Se recolectaron semillas de R. Soongorica en Laohukou, Wuwei, en la provincia de Gansu, China (102°58′E, 38°44′N; elevación 1315–1375 m), a finales de octubre de 2019. La temperatura media anual, las precipitaciones y La evaporación de esta área de muestreo es de 7,5 °C, 110 mm y 2.646 mm, respectivamente. Las semillas (números de vale: 063–2) fueron identificadas por el Dr. X. Liu, en la Estación de Estudios Nacionales del Instituto de Gansu Minqin para Ecosistemas de Estepas del Desierto (MSDSE); Las muestras de semillas se depositaron en el herbario de la estación experimental de investigación científica del huerto de semillas de Longqu, de la Academia de Investigación de Bosques de Conservación de Recursos Hídricos de Qilian de la provincia de Gansu, en Zhangye. Estas semillas se colocaron dentro de un gabinete de almacenamiento de semillas (CZ-250FC, Top Yunong, Zhejiang, China) hasta su uso posterior. Los materiales vegetales se recolectaron estrictamente de acuerdo con el Reglamento técnico para la recolección de semillas de plantas silvestres raras y en peligro de extinción de la República Popular China (LYT2590–2016).

La investigación experimental en plantas se llevó a cabo de acuerdo con los reglamentos técnicos para el cultivo de semillas de árboles (DB11T476-2007), la Norma de la Industria Forestal (LY/T 1898–2010) y la Norma de prueba de conservación de suelo y agua (SD 239–87) emitida por el Ministerio de Recursos Hídricos de la República Popular China. Los experimentos se llevaron a cabo en el cobertizo experimental número 4 de la Estación Experimental de Investigación Científica de Longqu Seed Orchard, en Zhangye, provincia de Gansu, China (100° 22'E, 38° 78'N; elevación 1591-1681 m). En abril de 2020, se seleccionaron semillas uniformes de tamaño completo y se desinfectaron durante 8 minutos con NaClO al 1 % y se enjuagaron seis veces con agua ultrapura. Luego se sembraron las semillas limpias en una bandeja de plugs (8,5 cm de altura x 4,5 cm de diámetro, con orificios de drenaje en la parte inferior) llena de tierra vegetal, arena de cuarzo y vermiculita (3:1:1) y se regaron por aspersión con agua subterránea. . Se cultivaron en invernadero a una temperatura de 25 ± 1 °C bajo 50% de humedad con ventilación y luz natural. En julio de 2020, se seleccionó suelo agrícola local para su uso en los experimentos en macetas; este tipo de suelo es el de suelo desértico irrigado. Antes del trasplante, se utilizó un analizador inteligente de nutrientes del suelo (TPY-6A, Top Yunong, Zhejiang, China) para determinar el fósforo disponible, el nitrógeno amónico, la salinidad y el pH del suelo analizado, que fueron 26,6 mg/kg, 10,0 mg, 0,2% y 8,3, respectivamente. A continuación, las plántulas germinadas uniformemente se transfirieron a macetas de plástico que contenían 2,5 kg de tierra (dimensiones de la maceta: 23 cm de ancho en la parte superior, 13 cm de ancho en la parte inferior y 14 cm de altura). Se utilizaron sistemas inteligentes de control de riego para mantener el contenido de agua del suelo cerca de la capacidad de campo (es decir, 60%). Los tratamientos con sal se aplicaron después de 1 mes de plántula lenta. Las plántulas se adelgazaron a cuatro plantas por maceta, con cinco macetas en cada grupo a las que se suministró NaCl 0 (control, A), 200 (bajo en sal, B) o 500 (alto en sal, C), para un total de tres. grupos de tratamiento (15 macetas, 60 plántulas en total). Para reducir el error de medición, cada grupo fue evaluado tres veces (Tabla 3). De acuerdo con el diseño experimental, la solución de NaCl correspondiente se preparó con agua desionizada y, con una jeringa, se vertió uniformemente alrededor del sistema radicular de las plantas de R. Soongorica. Para evitar el shock osmótico en las plántulas causado por una reacción de choque salino, la concentración objetivo se alcanzó durante un período de 24 h mediante aplicaciones graduales de sal. El tratamiento con NaCl durante 24 a 48 h se estableció como tratamiento con NaCl el día 0 y los índices relevantes se midieron después de 3 días.

Las 10 plantas de cada grupo de tratamiento fueron lavadas con agua destilada y secadas con papel absorbente. Luego contamos su tallo principal, ramas y hojas por encima de la rizosfera, como partes de la planta aéreas. Se obtuvo el peso fresco (FW) de las raíces y partes aéreas de las plantas y se calcularon sus valores medios por planta. Luego se secaron (a 105 °C en una estufa durante 30 min y se secaron nuevamente hasta peso constante a 80 °C) y se volvieron a pesar. Calculamos su relación raíz/brote (R/T) = peso seco de la parte subterránea/peso seco de las partes aéreas.

La superficie total de la hoja de una sola planta se midió con un analizador de área foliar (LI-3000C, Legol Tech, Beijing, China). Primero se midió el área de dos láminas de plástico limpias para eliminar errores. Las hojas de R. Soongorica se retiraron con tijeras y pinzas, se colocaron individualmente entre las dos láminas de plástico y se pasaron por debajo del cabezal de escaneo, para obtener su superficie total.

La conductividad relativa de cada muestra se midió según el método de medición de Hu et al.56, con algunas modificaciones aplicadas. Pesamos 0,3 g de hojas frescas de R. Soongorica, enjuagamos las manchas superficiales, las secamos con papel absorbente, las colocamos en una botella cónica de 50 ml, agregamos 20 ml de agua desionizada y las colocamos a temperatura ambiente durante 3 h, luego medimos la conductividad de la solución con un conductímetro (DDS-W, Bant instrument, Shanghai, China), la registramos, luego los pusimos en un baño de agua termostático a 100 °C, lo dejamos hervir durante 15 minutos y lo enfriamos. , y finalmente determinó la conductividad de la solución como R2. La conductividad relativa (%) en las hojas se calculó como conductividad/conductividad final × 100%. El contenido de prolina de las hojas de R. Soongorica se determinó según lo descrito por Sajid et al.57.

El análisis proteómico diferencial y la identificación de proteínas realizados para hojas de R. Soongorica siguieron los métodos descritos por Kumaravel et al.58, Holáet et al.59 y Kumar et al.60, con algunas modificaciones introducidas. La preparación de bibliotecas de proteomas y su secuenciación profunda fueron realizadas por Naomi Metabolic Technology Corporation (Suzhou, China).

Para ello, se tomó una muestra de hoja determinada de un refrigerador de temperatura ultrabaja (–80 °C), se molió hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido a baja temperatura y se colocó en un tubo EP. Luego se añadió una submuestra de polvo de 100 μL a un tubo EP nuevo, al que se le agregaron 500 μL de metanol, se mezcló bien y se dejó reposar en hielo durante 10 min, después de lo cual se centrifugó (14 000 × g, 4 °C). ) durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante resultante (repetido cuatro veces). Finalmente, el residuo de metanol en el precipitado se limpió con 1 × PBS, se centrifugó (14 000 × g, 4 ° C) durante 5 minutos y luego se recogió el precipitado. A cada muestra, se agregaron 500 μL de un tampón de lisis de urea 8 M y se sometió a ultrasonido en hielo durante 10 minutos (potencia: 15%, ultrasonido 3 s, parada 3 s). La proteína se cuantificó mediante electroforesis SDS-PAGE.

De acuerdo con los resultados cuantitativos del diagrama electroforético, de cada muestra se tomaron 200 μL de lisado proteico y se colocaron en un tubo centrífugo para una digestión enzimática. Agregamos 2 μL de DTT 1 M (DL-Ditiotreitol, Promega, Beijing, China) a cada tubo, lo mezclamos, lo calentamos a 56 °C durante 15 minutos y lo centrifugamos brevemente, después de lo cual se enfrió a temperatura ambiente. Cada muestra se dividió en cuatro tubos: 50 μL por tubo, a los que se agregaron 150 μL de ABC 50 mM (kit Vectastain ABC, Jinpan, Shanghai, China) para lograr una concentración de urea 2 M. A continuación, agregamos 1,5 μg de tripsina (Putai, Hangzhou, China) a cada tubo, lo mezclamos con una pistola de pipetas, lo cortamos enzimáticamente a 37 °C durante 4 h, luego agregamos 1,5 μg de tripsina, cortado enzimáticamente a 37 °C durante la noche. . Después de este proceso de digestión enzimática, se agregaron 20 μL de FA al 10 % (Fisher Scientific, A117-50, Fisher, Estados Unidos) y se centrifugaron a 14 000 × g, del cual se eliminó el sobrenadante para desalar. Finalmente, se tomó una muestra de cada grupo y cada una se analizó mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem durante 1 h.

El péptido marcado se disolvió en un tampón TEAB (carbonato de trietilamina) 0,1 M (pH = 8,5). Sacamos un tubo que contenía 0,1 mg del reactivo TMT (TMT10plex™, Thermo Scientific™, America), le agregamos 12 μL de acetonitrilo, lo agitamos durante 10 s, luego lo colocamos a temperatura ambiente durante 5 min y repetimos el vortex. (3 veces) para garantizar que el reactivo TMT se haya mezclado completamente. Luego se retiraron 10 μl del péptido (10 μg) y se agregaron al reactivo TMT correspondiente, de acuerdo con la tabla de información de etiquetado (Tabla 4). Se marcaron diferentes muestras con un reactivo de etiquetado diferente, se mezclaron completamente mediante agitación vorticial y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 h. Después de eso, se detuvo la reacción de etiquetado. Se tomó una muestra de 1 μg de esta mezcla y se mezcló con 150 μL de FA al 1% para desalar. Para la detección se utilizó el método de espectrometría de masas, para lo cual la eficiencia de etiquetado debe ser superior al 95% para alcanzar el estándar. Las muestras de mezcla restantes se almacenaron a –80 °C para ser separadas. El eluyente se mezcló en dos fracciones mediante el método de intercambio catiónico fuerte (SCX) y luego las dos fracciones se agregaron a diferentes columnas de fase inversa C18. Los péptidos se eluyeron con una solución CAN (nitrato de amonio y cerio) de 80 μl, Fisher Scientific, Pittsburgh, Estados Unidos. Finalmente, los péptidos eluidos se mezclaron en seis fracciones y se almacenaron a –80 °C para la detección por espectrometría de masas.

Para la recopilación de datos se utilizó el espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). La fuente de iones fue una fuente de iones de electropulverización (NSI) de nanocorriente con un voltaje de pulverización de 2200 V y una temperatura capilar de transporte de iones de 320 °C. Los datos de espectrometría de masas se recopilaron en el modo de iones positivos mediante el modo de adquisición dependiente de datos (DDA). Orbitrap se utilizó para escaneos completos en el nivel 1. La adquisición de espectrometría de masas secundaria se realizó mediante fragmentación de iones originales con un 38% de disociación por colisión de alta energía (HCD), y los iones fragmentados resultantes se detectaron en Orbitrap.

Después de completar el escaneo de MS, se obtuvo el cromatograma de flujo de iones total de la señal de MS. Después de que los datos del espectro de masas se ingresaron en el software Proteome Discoverer (PD) (v2.2, Thermo Fisher Scientific), el software primero analizó el espectro de masas. Estos datos del espectro de masas se buscaron mediante el programa operativo Sequest integrado en el software PD. El mismo software realizó un análisis cualitativo según los resultados de la búsqueda Sequest y el espectro (después del primer paso de selección). Al extraer el valor de la señal de los iones que informan TMT, se recalculó el valor de cuantificación de proteínas, esto representado aquí por su mediana, donde el valor de cuantificación de proteínas fue la suma de los valores de cuantificación de péptidos obtenidos.

Se utilizó Microsoft Excel 2016 para el procesamiento de datos y el software Origin 8.0 para el trazado. Se utilizó el software de análisis SPSS 22.0 para el análisis de varianza (ANOVA). La base de datos de enriquecimiento funcional no proporcionó el análisis de enriquecimiento de las hojas de R. Soongorica. En consecuencia, las secuencias de proteínas identificadas se compararon con las bibliotecas de referencia de GO y KEGG mediante búsquedas BLAST. Para su cuantificación relativa, se estableció la abundancia de expresión de proteínas para determinar la significación estadística de la diferencia e identificar con precisión las DEP inducidas por el estrés salino. Cuando el múltiplo de diferencia de proteínas fue> 1,5 y su valor P <0,05, se consideró una proteína regulada positivamente; cuando la diferencia múltiple fue <0,66 y el valor P <0,05, la proteína se designó como regulada negativamente. Las funciones de todas las proteínas identificadas se determinaron mediante la búsqueda de análisis GO (Gene Ontology) en la base de datos UniProt (//www.uniprot.org), y las proteínas se clasificaron según sus funciones principales. Utilizamos la base de datos de interacción de proteínas string-DB (http://string-db.org/) (seleccionando Arabidopsis thaliana) para analizar la interacción de las proteínas comparadas y expresadas diferencialmente.

La investigación experimental y los estudios de campo sobre plantas o semillas en este trabajo cumplen con la Declaración de Política de la UICN sobre Investigación con Especies en Riesgo de Extinción y la Convención sobre el Comercio de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres.

Como planta secretora de sal, R. Soongorica experimentó una serie de cambios en su crecimiento y expresó proteínas de manera diferencial en sus hojas mientras se encontraba en condiciones controladas de estrés salino. En términos de sus índices de crecimiento, la baja sal (200 mM·L-1) promovió significativamente el crecimiento vegetativo (área foliar total, peso fresco total, relación raíz-brote) de plántulas de R. Soongorica, al tiempo que aumentó el contenido de prolina de sus hojas. El análisis proteómico reveló que las proteínas relacionadas con la energía y el metabolismo (P5CR, CSY4) y las proteínas ribosómicas (RPL2-A, RPL12A, RPS6B) estaban reguladas positivamente en condiciones de bajo estrés salino. Sin embargo, el crecimiento de las plántulas de R. Soongorica se inhibió significativamente en condiciones de alta salinidad (500 mM·L-1). La razón de esto puede ser que el alto contenido de sal disminuye la abundancia de proteínas asociadas con la fotosíntesis (RCA, PSAF, PSAN, PSB27-1), proteínas ribosómicas (RPS10, RPS2D, RPS9, RPL7AA), pero aumenta la abundancia de una cadena peptídica. factor de liberación (AT2G47020). Mientras tanto, R. Soongorica puede responder a un entorno de alto estrés salino regulando positivamente la expresión de proteínas relacionadas con la energía y el metabolismo (VHA-A, VHA-E1, AHA4, CSY4, PCK1), proteínas relacionadas con la defensa y el antiestrés ( P5CR, FC2, SYP71, SYP131) y proteínas ribosómicas (RPL2-A, RPL12A) en sus hojas. Estas proteínas desempeñan un papel importante como proteína diana potencial que confiere la capacidad de tolerancia a la sal de R. Soongorica. Este estudio sienta las bases para comprender mejor el mecanismo de regulación molecular subyacente a la respuesta al estrés salino de R. Soongorica.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26527-x

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El trabajo contó con el apoyo de los Programas Regulares de Asistencia Científica y Tecnológica a los Países en Desarrollo (KY202002011); los Fondos de Demostración de Promoción de la Ciencia y la Tecnología Forestales de China (2020ZYTG15); la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Gansu (20JR5RA035); el Programa de Bases y Talentos de Innovación Científica y Tecnológica de la Provincia de Gansu (17JR7WA018); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32160407); y las características fisiológicas y el mecanismo molecular de la tolerancia a la sal de la reaumuria en respuesta al estrés por sal (GAU-QDFC-2021-10).

Facultad de Silvicultura, Universidad Agrícola de Gansu, Lanzhou, 730070, China

Shipeng Yan y Peifang Chong

Academia de la Provincia de Gansu del Instituto de Investigación de Bosques para la Conservación de Recursos Hídricos de Qilian, Zhangye, 734000, China

Ming Zhao y Hongmei Liu

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SY y PC concibieron y diseñaron los experimentos; SY y MZ realizaron los experimentos; SY y PC analizaron los datos; MZ y HL contribuyeron con reactivos, materiales y herramientas de análisis; SY escribió y revisó el artículo. Todos los autores contribuyeron al diseño del proyecto de investigación y a la preparación del manuscrito.

Correspondencia a Peifang Chong.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Se revisó la versión original en línea de este artículo: La versión original de este artículo contenía un error en la sección de Agradecimientos. La información completa sobre las correcciones realizadas se puede encontrar en la corrección de este artículo.

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Reimpresiones y permisos

Yan, S., Chong, P., Zhao, M. et al. Respuesta fisiológica y análisis proteómico de Reaumuria Soongorica bajo estrés salino. Informe científico 12, 2539 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-06502-2

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Recibido: 29 de octubre de 2021

Aceptado: 25 de enero de 2022

Publicado: 15 de febrero de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-06502-2

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