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Jul 17, 2023

Análogos de MOG para explorar el farmacóforo MCT2, α

Communications Biology volumen 5, Número de artículo: 877 (2022) Cite este artículo 1378 Accesos 1 Citas 12 Detalles de Altmetric Metrics Una corrección del editor a este artículo se publicó el 27

Biología de las comunicaciones volumen 5, número de artículo: 877 (2022) Citar este artículo

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Se publicó una corrección del editor a este artículo el 27 de septiembre de 2022.

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El α-cetoglutarato (αKG) es un nodo metabólico central con una amplia influencia en la fisiología celular. El análogo de αKG, N-oxalilglicina (NOG) y su profármaco derivado permeable a la membrana, dimetil-oxalilglicina (DMOG), se han utilizado ampliamente como herramientas para estudiar las prolil hidroxilasas (PHD) y otros procesos dependientes de αKG. En los medios de cultivo celular, DMOG se convierte rápidamente en MOG, que ingresa a las células a través del transportador de monocarboxilato MCT2, lo que lleva a concentraciones intracelulares de NOG que son suficientemente altas como para inhibir las enzimas de glutaminolisis y causar citotoxicidad. Por lo tanto, el grado de inestabilidad de (D)MOG junto con los niveles de expresión de MCT2 determinan los objetivos intracelulares con los que se relaciona NOG y, en última instancia, sus efectos sobre la viabilidad celular. Aquí diseñamos y caracterizamos una serie de análogos de MOG con el objetivo de mejorar la estabilidad del compuesto y explorar los requisitos funcionales para la interacción con MCT2, un miembro relativamente poco estudiado de la familia SLC16. Informamos análogos de MOG que mantienen la capacidad de ingresar a las células a través de MCT2 e identificamos compuestos que no inhiben la glutaminolisis ni causan citotoxicidad, pero que aún pueden inhibir los PHD. Utilizamos estos análogos para demostrar que, en nuestras condiciones experimentales, la activación de mTORC1 inducida por glutaminolisis puede desacoplarse de la actividad de PHD. Por tanto, estos nuevos compuestos pueden ayudar a desconvolucionar los efectos celulares que resultan de la acción polifarmacológica del NOG.

El estudio del metabolismo se ha visto favorecido durante mucho tiempo por el uso de análogos de metabolitos que permiten la inhibición rápida y reversible de enzimas y vías en diferentes entornos experimentales1. En el campo del metabolismo del cáncer, compuestos análogos como la 2-desoxiglucosa, la 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON) y el dicloroacetato (DCA) continúan complementando los enfoques genéticos para analizar las fortalezas y vulnerabilidades asociadas con los oncogenes. cambios metabólicos en los tumores2,3,4. Los análogos de metabolitos también se encuentran entre algunos de los compuestos quimioterapéuticos más importantes de uso clínico: desde gemcitabina y 5-fluorouracilo (5-FU), análogos de nucleósidos utilizados como terapias en el cáncer de páncreas y colorrectal; hasta metotrexato y pemetrexed, análogos del folato administrados para tratar una variedad de neoplasias malignas5,6. Por lo tanto, el desarrollo y refinamiento de análogos de metabolitos puede proporcionar herramientas valiosas para estudios mecanicistas tanto del metabolismo como de la tumorigénesis.

El α-cetoglutarato (αKG) es un nodo metabólico clave y la comprensión de su compleja biología ha sido facilitada por el análogo estructural N-oxalilglicina (NOG), que se ha utilizado ampliamente in vitro junto con su derivado permeable a las células, la dimetil-oxalilglicina (DMOG). )7,8,9 (Figura 1a). Más comúnmente, DMOG se utiliza para provocar la señalización de hipoxia mediante la inhibición de las enzimas del dominio prolil hidroxilasa (PHD), lo que conduce a la estabilización del factor de transcripción Factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α)8,10. La estabilización de HIF1α es un objetivo terapéutico en afecciones que van desde isquemia y anemia hasta enfermedades inflamatorias11,12 y, en estos entornos, estudios previos han utilizado DMOG para demostrar los posibles beneficios terapéuticos de la inhibición de los PHD13,14.

un esquema (creado con Biorender) que representa las estructuras químicas de DMOG, MOG y NOG, su permeabilidad celular relativa y objetivos celulares dependiendo de las concentraciones intracelulares de NOG ([NOG]IC) que provocan). DMOG se convierte en MOG y posteriormente en NOG, el análogo activo de αKG. DMOG es permeable a las células, mientras que MOG se transporta a través de MCT2, lo que genera una [NOG]IC más alta en comparación con la provocada por DMOG. La [NOG]IC alta inhibe las enzimas metabólicas además de las PHD. NOG no puede atravesar la membrana plasmática. b Análisis de la estabilidad de MOG sintético a lo largo del tiempo en sangre entera de ratón mediante LC-MS (n = 3 réplicas técnicas). c Análisis LC-MS de la estabilidad de DMOG en sangre entera de ratón a lo largo del tiempo (n = 3 réplicas técnicas). El DMOG se convierte muy rápidamente en MOG, que también es inestable y posteriormente forma NOG con una cinética similar a la del MOG sintético medido en (b). La tabla muestra las vidas medias calculadas de la conversión de DMOG a MOG y posteriormente a NOG, o de la conversión de MOG sintético a NOG a partir de los datos mostrados en los paneles (b y c). d Estructuras de análogos de reemplazo de éster metílico de glicinato de MOG diseñadas, sintetizadas y reportadas en este trabajo. (i) ésteres alquílicos más voluminosos (2,3), (ii) sustituyentes α-metilo (4–6), (iii) análogo de cetona (7), (iv) heterociclos aromáticos de 5 miembros (8–10). e Ruta sintética para la preparación de análogos de MOG 2-10 que se muestra en el panel (d).

Además de ser un cofactor para las enzimas dependientes de αKG, αKG es también el punto de entrada de los carbonos de glutamina al ciclo del TCA, un sustrato para un gran número de reacciones de transaminasas, y también se ha demostrado que media en la activación del objetivo mecanístico de complejo de rapamicina 1 (mTORC1) por glutamina15. αKG puede modificar los perfiles epigenéticos durante el desarrollo9 y en contextos patógenos16 regulando las hidroxilasas de translocación diez-once (TET) y las desmetilasas de Jumonji. Además, αKG puede influir en el envejecimiento17, a través de un mecanismo aún no claro, lo que destaca que aún queda mucho por descubrir sobre las funciones fisiológicas de este metabolito.

Aunque DMOG es capaz de inhibir las PHD y, por lo tanto, estabilizar HIF1α en una amplia gama de líneas celulares, es selectivamente tóxico para algunas, de una manera que se correlaciona fuertemente con el nivel de expresión del transportador de monocarboxilato MCT218, un miembro de la familia de transportadores SLC16. . DMOG es inestable en medios de cultivo celular y se convierte de forma no enzimática en monocarboxilato de metiloxalilglicina (MOG) con una vida media de 10 min. MOG es un sustrato de MCT2, cuya expresión determina la concentración de NOG que se acumula intracelularmente ([NOG]IC). En células con alta expresión de MCT2, [NOG]IC puede alcanzar niveles milimolares, que son lo suficientemente altos como para activar adicionalmente enzimas de unión a αKG de baja afinidad, como la isocitrato deshidrogenasa (IDH) y la glutamato deshidrogenasa (GDH), lo que lleva a un metabolismo gravemente alterado y citotoxicidad. Este modo de acción polifarmacológico dificulta desentrañar los mecanismos exactos que explican los efectos de NOG en la fisiología celular.

Además de MOG, MCT2 transporta monocarboxilatos endógenos que van desde piruvato y lactato hasta cuerpos cetónicos más grandes, como β-hidroxibutirato, acetoacetato, α-cetoisovalerato y α-cetoisocaproato19 (Figura complementaria 1a) con una mayor afinidad que los otros miembros de la familia SLC169. MCT2 desempeña funciones fisiológicas importantes, incluida la captación de lactato secretado por astrocitos en las neuronas del cerebro20,21. MCT2 se expresa altamente en algunos cánceres humanos (Figura 1b complementaria) y se ha propuesto como un biomarcador para el cáncer de próstata22, además de tener funciones protumorales23 y prometastásicas24 en el cáncer de mama. Por lo tanto, existe una necesidad emergente de desarrollar sondas químicas para estudiar las funciones de MCT2.

Aquí, informamos el diseño y la síntesis de análogos basados ​​en MOG y los utilizamos para explorar el farmacóforo MCT2 y la interferencia dependiente de [NOG]IC con objetivos intracelulares en el contexto de sus efectos sobre la proliferación y supervivencia celular.

Con base en nuestros hallazgos anteriores18, razonamos que MOG podría usarse como un andamio para explorar tanto el espacio químico acomodado por MCT2 como las funciones celulares de las proteínas de unión a αKG. La conversión de DMOG a MOG y posteriormente NOG genera compuestos con capacidad progresivamente disminuida para atravesar la membrana plasmática (Fig. 1a), por lo que la estabilidad de MOG y, por extensión, la de sus análogos, podría influir en su modo de entrada a las células. y posteriormente el grado de compromiso del objetivo intracelular. Por lo tanto, con la perspectiva de generar compuestos que también podrían usarse en el futuro para estudios in vivo, primero determinamos la estabilidad de MOG en sangre entera de ratón mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).

El MOG sintético se convirtió en NOG con una vida media corta y comparable a la del MOG que se generó transitoriamente a partir de DMOG (Fig. 1b, c). En particular, la degradación de DMOG a MOG fue aún más rápida, con una vida media de sólo 0,61 minutos. Las vidas medias de DMOG y MOG en sangre de ratón son notablemente más cortas que las medidas previamente en solución acuosa18, lo que atribuimos al alto nivel bien documentado de actividad esterasa en sangre. Estos datos sugirieron que aumentar la estabilidad sería un atributo deseable de los análogos de MOG.

Diseñamos y sintetizamos compuestos utilizando MOG como andamio químico (1, Fig. 1d, e). Con base en nuestros hallazgos anteriores y en el hecho de que los ésteres se usan típicamente como profármacos para fármacos de ácido carboxílico de mala absorción25,26,27,28, nos centramos en el éster metílico de MOG como la causa principal de la inestabilidad del compuesto en el plasma. Además, como se desconoce el farmacóforo necesario para el transporte impulsado por MCT2, las sustituciones se mantuvieron relativamente conservadoras. Por lo tanto, reemplazamos el éster de glicinato en MOG con i) ésteres alquílicos más voluminosos como etilo o isopropilo (compuestos 2 a 3), ii) ésteres que poseen sustituyentes metilo en la posición α (compuestos 4 a 6), iii) una cetona (compuesto 7), o iv) heterociclos aromáticos de 5 miembros (compuestos 8-10). Es importante destacar que se predice que los compuestos 1 a 6 se deesterificarán para formar NOG o NOG sustituido con metilo y, por lo tanto, es probable que también puedan atacar objetivos intracelulares.

Los ésteres 2 y 3 se diseñaron para aumentar mínimamente el impedimento estérico del sustituyente éster, lo que se esperaría que disminuyera la inestabilidad tanto química como mediada por enzimas29,30,31,32,33. También exploramos los ésteres ramificados (4–6), ya que las sustituciones en el carbono α pueden aumentar la estabilidad química34 y las esterasas celulares pueden exhibir una selectividad sorprendente hacia los ésteres complejos35,36,37. Las cetonas (7) y las amidas son ésteres isósteros clásicos38, y la amida se utiliza normalmente para mejorar la estabilidad de los fármacos39. En particular, estos pequeños cambios pueden tener un efecto sustancial sobre la afinidad de unión de los compuestos a sus objetivos40. Finalmente, los heterociclos de anillo de 5 miembros, como los oxadiazoles (10) o los oxazoles (8), también se han utilizado con éxito como ésteres bioisósteros41,42,43,44.

Para determinar la dependencia de MCT2 de la absorción de análogos de MOG en las células, utilizamos células HCC1569, una línea de cáncer de mama humano que expresa niveles muy bajos de MCT2 y es naturalmente resistente a la toxicidad inducida por MOG18. Comparamos la absorción del compuesto en estas células transducidas con un plásmido de 'vector vacío' de control (HCC1569-EV) con una línea isogénica que expresa MCT2 humano exógeno (HCC1569-MCT2) (Fig. 2a, b). Después de la incubación de ambas líneas celulares con cada análogo durante 4 h, probamos si los compuestos o sus derivados podían detectarse intracelularmente. En el caso de los compuestos 7 a 10, detectamos el compuesto original intacto; sin embargo, como se esperaba, todos los compuestos 1 a 6 se desesterificaron intracelularmente y, por lo tanto, en estos casos cuantificamos el NOG, o el NOG sustituido con metilo que se formó. Los análogos de MOG intactos o sus productos se acumularon intracelularmente en diversos grados, y los derivados de los ésteres alquílicos más voluminosos (2 y 3) y los sustituyentes α-metilo (4-6) alcanzaron concentraciones en el rango milimolar (Fig. 2c). Se espera que la desesterificación de los compuestos 1 a 6 dentro de las células disminuya aún más la permeabilidad de su membrana, lo que podría atraparlos efectivamente dentro de las células y puede explicar las concentraciones más altas observadas. Definimos la captación dependiente de MCT2 como un aumento del doble en la acumulación de compuestos en células HCC1569-MCT2 en comparación con las células HCC1569-EV45. La dependencia de la absorción de MCT2 varió entre los grupos de compuestos, pero se mantuvo en los dos ésteres alquílicos más voluminosos (siendo el cambio en la absorción del compuesto 2 comparable al de MOG), así como en los 3 grupos de 5 miembros. heterociclos aromáticos (compuestos 8-10, Fig. 2d).

a Esquema para ilustrar el sistema celular utilizado para evaluar la dependencia de la captación celular del análogo de MOG en MCT2. Se transdujeron células de cáncer de mama humano HCC1569 con un control de vector pBabePuro (EV) vacío o con pBabePuro-MCT2 para expresar de manera estable MCT2 exógeno. b Transferencia Western que demuestra la expresión de MCT2 exógeno en células HCC1569-EV o HCC1569-MCT2 generadas como se describe en (a). c Concentración de cada uno de los análogos, o de los compuestos indicados que producen en las células, en células HCC1569-EV o HCC1569-MCT2 incubadas durante 4 h con 1 mM de cada uno de los análogos indicados (n = 4 pocillos independientes, media ± DE) . d Diferencia en veces en la concentración intracelular de cada análogo, o los compuestos indicados que producen en las células, en células HCC1569-MCT2 en relación con las células HCC1569-EV. Los análogos con un aumento >2 veces (línea discontinua) se consideraron absorbidos de manera dependiente de MCT2 (n = 4, media ± DE). e Izquierda: esquema (creado con Biorender) que ilustra la estrategia para probar los análogos 4 a 7 como supuestos inhibidores de MCT2). En las células tratadas con MOG, NOG inhibe las enzimas metabólicas y, por lo tanto, conduce a una disminución de la respiración. Los supuestos inhibidores de MCT2 previenen la entrada de MOG y se espera que atenúen la inhibición de la respiración inducida por MOG. Derecha: cambio medio ± DE en la respiración celular basal (calculado a partir de los datos que se muestran en el panel central) después del tratamiento de células INS1-EV o INS1-MCT2 con MOG en presencia o ausencia de los análogos de MOG indicados. MOG no inhibe la respiración en ausencia de expresión exógena de MCT2, lo que ilustra la especificidad del ensayo. Se utilizó AR-C155858 como control positivo para la inhibición de MCT2. El análogo cetónico 7 atenúa la inhibición de la respiración inducida por MOG, lo que coincide con que este compuesto sea un inhibidor de MCT2. Significancia probada mediante un ANOVA unidireccional con la prueba de Dunnett para comparaciones múltiples (n = 2–5 mediciones independientes). f Análisis LC-MS para evaluar la estabilidad de MOG o los análogos 2 y 3 de alquil MOG más voluminosos en medios de cultivo celular a lo largo del tiempo (n = 3 réplicas independientes).

Aunque encontramos un aumento modesto en la absorción de los análogos de α-metilo y cetona en las células que expresan MCT2 en comparación con los controles, estos compuestos no cumplieron con el criterio de corte doble. Dado que estos compuestos (4–7) albergan modificaciones menores de la estructura MOG, consideramos si podrían interactuar con MCT2 de manera inhibidora. Para probar esta idea, evaluamos la capacidad de 4–7 para prevenir la inhibición de la respiración dependiente de MCT2 inducida por MOG en células INS1 (una línea de células β pancreáticas de rata con baja expresión de todas las isoformas endógenas de MCT46) que expresaban MCT2 humano exógeno. (INS1-MCT2) (Fig. 2e y Métodos). Tras el tratamiento con MOG, la respiración basal de las células INS1-MCT2 (pero no del control EV) disminuyó en un 60%. AR-C155858, un inhibidor de MCT247 descrito previamente, impidió casi por completo la inhibición de la respiración por parte de MOG. La adición de los sustituyentes α-metilo no tuvo efecto sobre la disminución de la respiración inducida por MOG; sin embargo, la incubación conjunta con el compuesto 7 disminuyó el efecto inhibidor de MOG a la mitad. Es importante destacar que ninguno de los análogos por sí solo inhibió la respiración (Fig. 2e, panel central). Este hallazgo sugiere que la sustitución del éster de glicinato por un grupo cetona convierte al MOG de un sustrato a un inhibidor de MCT2.

Para probar si la diferencia en [NOG]IC en células tratadas con los análogos 2 y 3 puede deberse a una estabilidad alterada y, por lo tanto, a la disponibilidad del compuesto para las células, medimos la conversión de estos compuestos a NOG en medios de cultivo celular. Ambos compuestos demostraron una estabilidad similar y mejorada en comparación con MOG (Fig. 2f), lo que sugiere que el aumento de [NOG] IC en las células tratadas con el compuesto 2 en comparación con el compuesto 3 probablemente se deba a diferencias en el transporte o las tasas de deesterificación intracelular en lugar de diferencias en su estabilidad en los medios. Curiosamente, la vida media del compuesto 3 en la sangre fue significativamente más larga que la del MOG o el compuesto 2, lo que también se refleja en la mayor persistencia del 3 en comparación con el MOG en la sangre de los animales a los que se les administraron estos compuestos (Figura complementaria 2b).

En resumen, generamos análogos de MOG con dependencia diferencial de MCT2 para la entrada celular y con la capacidad de generar un rango de [NOG]IC. Otras investigaciones se centraron en compuestos que mostraban una absorción dependiente de MCT2.

MOG inhibe la proliferación celular y conduce a la apoptosis en células que expresan MCT2 de una manera que depende de [NOG]IC18. Por lo tanto, evaluamos si los ésteres alquílicos más voluminosos y los heterociclos aromáticos de 5 miembros mantienen la capacidad de provocar citotoxicidad en nuestro modelo de células HCC1569 ± MCT2. Durante 96 h, MOG inhibió la acumulación de masa celular de una manera dependiente de la concentración (Fig. 3a). Esta inhibición fue notablemente mayor en las células que expresan MCT2 y se asoció con una mayor apoptosis. Por el contrario, aunque los ésteres alquílicos más voluminosos (2, 3) también ralentizaron la acumulación de masa celular en mayor medida en las células HCC1569-MCT2 que en las células HCC1569-EV, no provocaron una apoptosis notable excepto en la concentración más alta. Los efectos citostáticos de los análogos 2 y 3 en células HCC1569-MCT2 fueron proporcionales a la [NOG] IC observada alcanzada después del tratamiento con estos compuestos, respectivamente (Fig. 3b). Los heterociclos aromáticos de 5 miembros (8-10) no afectaron la acumulación de masa celular, ni en presencia ni en ausencia de MCT2, excepto el compuesto 9, que, en la dosis más alta, provocó un pequeño aumento en la apoptosis.

a Mediciones de confluencia y apoptosis, a lo largo del tiempo, de células HCC1569-EV o HCC1569-MCT2 en presencia de análogos de MOG agregados a las células en las concentraciones indicadas a las 20 h (línea de puntos) (n = 3 pocillos independientes, media ± DE). b El grado de inhibición de la acumulación de masa celular después del tratamiento con 1 mM de los análogos indicados (datos del panel a) es proporcional a la [NOG]IC correspondiente provocada por cada análogo. Las barras de error representan ± DE. c Confluencia, a lo largo del tiempo, de células MCF7, SN12C o LN229 en presencia de los compuestos indicados agregados a las células a las 16 h (n = 3 pocillos independientes, media ± DE). d [NOG]IC en células MCF7, SN12C o LN229 tratadas con 1 mM de cada uno de los indicados durante 4 h (n = 4 pocillos independientes, media ± DE).

También probamos los efectos celulares y la absorción de nuestros análogos en células LN229 (glioblastoma), MCF7 (cáncer de mama) y SN12C (cáncer de riñón) que expresan MCT218 endógeno. MOG atenuó la acumulación de masa celular en las tres líneas celulares (Fig. 3c). Los compuestos 2 y 3 causaron una disminución pequeña o nula en la acumulación de masa celular y condujeron a una [NOG] ic mucho más baja en relación con la lograda con MOG (Fig. 3d). En particular, 2 y 3 provocaron [NOG] ic en estas células que fue casi 10 veces menor que el [NOG] ic provocado en las células HCC1569-MCT2 (Fig. 3b), lo que probablemente explica los efectos citostáticos atenuados de estos compuestos en células con niveles de expresión endógena de MCT2 en relación con las células que sobreexpresan MCT2.

En conjunto, estos hallazgos demostraron que la sustitución del éster metílico de MOG por ésteres alquílicos más voluminosos creó compuestos que, en condiciones de tratamiento equivalentes, producen niveles intracelulares de NOG más bajos y una citotoxicidad menor o nula en comparación con el MOG.

La expresión de MCT2 promueve la citotoxicidad inducida por MOG al provocar cambios metabólicos debido a la alta [NOG]ic18. Nuestra hipótesis fue que la falta de efectos citotóxicos de los análogos de MOG dependientes de MCT2 (2, 3, 8-10) estaba relacionada con una menor capacidad para perturbar el metabolismo. Para probar esta idea, tratamos las células durante 4 h con análogos de MOG y analizamos su metabolismo mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). Como se describió anteriormente 18, MOG causó una disminución característica dependiente de MCT2 en los intermedios del ciclo de TCA y un aumento en las concentraciones de aminoácidos (Fig. 4a y Fig. Suplementaria 3a, b). De acuerdo con nuestra hipótesis, esta firma metabólica se redujo notablemente en las células tratadas con cualquiera de los análogos probados (Figuras complementarias 3a, b). De manera similar, las células con niveles endógenos de MCT2 (MCF7, SN12C y LN229) mostraron una respuesta metabólica atenuada a los análogos 2 y 3 en comparación con MOG (Fig. 4a).

a Mapa de calor que muestra cambios log2 en la abundancia media de los metabolitos indicados en células MCF7, LN229 y SN12C tratadas durante 4 h con los compuestos indicados en relación con los controles tratados con DMSO (vehículo). Los metabolitos se ordenan de mayor a menor valor de cambio en la condición tratada con MCF7 MOG. b. Esquema para demostrar diferentes rutas de síntesis de citrato y patrones de etiquetado posteriores a partir de [U-13C]-glutamina. c Marcado de citrato de [U-13C]-Glutamina en células MCF7, LN229 o SN12C tratadas con 1 mM de cada uno de los análogos indicados durante 4 h. n = 4 pozos independientes, media ± DE; significancia probada mediante múltiples pruebas t con corrección de Holm-Sidak para comparaciones múltiples. (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). d Transferencia Western que muestra la expresión de la proteína HIF1α en células HCC1569-EV o HCC1569-MCT2 tratadas con 0,1 o 1,0 mM de los análogos indicados, o con DMSO durante 4 h. e Western blot que muestra los niveles de proteína de HIF1α, los productos proteicos del gen objetivo de HIF1α LDHA y PKM2, y el sustrato de la quinasa mTORC1 S6K (total y fosforilado en Thr389) en lisados ​​de células MCF7 tratadas con 1 mM de los compuestos indicados durante 4, 8 o 24h.

Los cambios metabólicos inducidos por una alta [NOG]IC son, en parte, impulsados ​​por la inhibición de GDH e IDH. En células marcadas con [U13C]-glutamina, el grado de inhibición de GDH o IDH se puede determinar monitorizando, respectivamente, los niveles del isotopólogo citrato m + 4 formado a partir del uso oxidativo de carbonos de glutamina en el ciclo canónico de TCA y el citrato m. + 5 isotopólogo producido por la carboxilación reductora de αKG (Fig. 4b)18.

El tratamiento de células con 2 o 3 no afectó el etiquetado de citrato m + 4 y causó una modesta disminución dependiente de MCT2 en citrato m + 5, que, sin embargo, fue significativamente menos pronunciada que la causada por MOG (Figura complementaria 3c). Los análogos demostraron efectos atenuados de manera similar en el marcaje de citrato derivado de glutamina [U13C] en células SN12C, MCF7 y LN229 (Fig. 4c). En particular, la modesta disminución en citrato m + 5 fue más pronunciada con 2 que con 3, lo que refleja la mayor [NOG] IC en las células tratadas con el primero (Fig. 3d).

En conjunto, estos análisis metabólicos apoyan la idea de que una CI de [NOG] más baja provocada por análogos de alquil-MOG más voluminosos no es suficiente para inhibir completamente el metabolismo de la glutamina y, junto con observaciones previas18, explican su menor capacidad para inducir citotoxicidad.

DMOG inhibe los PHD y, por lo tanto, promueve la estabilización de HIF1α a una [NOG]IC más baja que las requeridas para inhibir la glutaminolisis debido a la mayor afinidad de NOG por los PHD que por los objetivos metabólicos18. Para probar si el bajo [NOG]IC que encontramos con los análogos de MOG es suficiente para estabilizar HIF1α, tratamos las células durante 4 h con cada análogo a 1 mM (una concentración típica a la que se usa DMOG para estabilizar HIF1α en estudios de cultivo celular) y monitoreamos Niveles de HIF1α mediante transferencia Western. En las células HCC-1569 ± MCT2, cualquiera de los ésteres alquílicos (2, 3), que producen NOG intracelularmente, indujo la estabilización de HIF1α (Fig. 4d) de una manera dependiente de MCT2 y [NOG] IC. Por el contrario, los heterociclos aromáticos (8–10) no indujeron la estabilización de HIF1α, lo que sugiere que a pesar de la conservación del resto oxoacetato de NOG, la adición de un grupo aromático en el sitio glicinato es incompatible con la inhibición de los PHD en las concentraciones del compuesto que utilizamos. . En las células MCF7, los compuestos 2 o 3 estabilizaron HIF1α con una cinética similar a la de MOG (Fig. 4e). Es importante destacar que los niveles de proteína de lactato deshidrogenasa A (LDHA) y piruvato quinasa M2 (PKM2), dos dianas prototípicas del gen HIF1α, estaban igualmente regulados positivamente en respuesta al tratamiento con los compuestos 2 y 3, y con una cinética comparable. Estos datos mostraron que, aunque los análogos 2 y 3 conducen a una [NOG]IC más baja que MOG, estabilizan HIF1α en la misma medida que MOG en células con expresión endógena de MCT2.

Además de la regulación de HIF1α, también se ha informado que los PHD median la activación de mTORC1 impulsada por la glutaminolisis48. Dado que los análogos de MOG no inhiben la glutaminolisis pero aún pueden inhibir los PHD, comparamos sus efectos sobre la fosforilación de la proteína ribosómica S6 quinasa (S6K) (una lectura típica de la actividad de mTORC1) con los de MOG, que puede inhibir tanto la glutaminolisis como los PHD. Aunque 2 y 3 podrían inhibir los PHD (como lo muestra la estabilización de HIF1α), no lograron inhibir la señalización de mTORC1 después de 4 u 8 h de tratamiento (Fig. 4e). Los tres compuestos suprimieron la fosforilación de S6K después de 24 h, lo que sugiere que esta inhibición latente de mTORC1 probablemente sea secundaria a la activación de HIF1α en lugar de un efecto directo de los análogos. Por lo tanto, la comparación de los efectos de los análogos con MOG reveló que los efectos inhibidores de (D)MOG en la señalización de mTORC1 probablemente se deben a una glutaminolisis atenuada en lugar de a la inhibición de los PHD. De acuerdo con esta idea, el inhibidor de PHD más específico, FG4592, no logró suprimir la activación de mTORC1 después de volver a alimentar a las células hambrientas con aminoácidos (un activador prototípico de mTORC1) (Figura complementaria 3d).

En resumen, nuestros datos mostraron que los compuestos 2 y 3 condujeron a la inhibición de los PHD pero causaron efectos metabólicos mínimos, citotoxicidad e inhibición de mTORC1 en comparación con MOG, lo que nos permitió desacoplar los efectos celulares de NOG provocados por sus objetivos metabólicos de los que ocurren debido a los doctorados.

El metabolismo tiene efectos de gran alcance en la fisiología celular que van más allá de la acumulación de biomasa, la producción de energía y el equilibrio redox. Un ejemplo prototípico de este concepto es el α-KG, un nodo metabólico central que no solo es el punto de entrada de los carbonos derivados de la glutamina al ciclo del TCA, sino que también desempeña importantes funciones reguladoras para proteínas de señalización clave como mTOR y HIF1α8,15. Además, αKG actúa como cofactor para las enzimas modificadoras del ADN y la cromatina, como las TET hidroxilasas9 y las desmetilasas Jumonji7; en consecuencia, las fluctuaciones en la concentración de αKG también pueden influir en los procesos epigenéticos, lo que produce efectos duraderos dentro de la célula. NOG es un análogo estructural de αKG que se ha utilizado para ayudar a comprender muchas de las funciones establecidas de este importante metabolito. DMOG es un éster de NOG permeable a la membrana que se desesterifica rápidamente en medios de cultivo celular al monocarboxilato MOG, un sustrato del transportador MCT2. El nivel de expresión de MCT2 determina la [NOG]IC, que, en niveles altos, inhibe una serie de objetivos metabólicos de baja afinidad como GDH e IDH, lo que conduce a toxicidad en las células cancerosas que expresan MCT218.

Además de su uso in vitro, el DMOG se ha utilizado ampliamente, principalmente como estabilizador farmacológico de HIF1α, in vivo para estudios preclínicos49,50 donde, típicamente, se administra en concentraciones que exceden con creces las requeridas para inhibir la actividad intracelular deseada. objetivos11,51,52. La inestabilidad del DMOG como resultado de la deesterificación química o enzimática y la consiguiente pérdida de permeabilidad celular podrían explicar la disparidad de potencia observada entre los estudios in vitro (enzima purificada) e in vivo, particularmente a la luz del alto nivel de actividad esterasa en sangre. En apoyo de esta hipótesis, aquí mostramos que DMOG y MOG se convierten rápidamente en NOG en la sangre, cada uno con una vida media de menos de 5 minutos. Por lo tanto, esta mala estabilidad en la sangre debería ser una consideración clave al utilizar DMOG como compuesto herramienta in vivo.

MCT2 tiene una serie de funciones fisiológicas y patológicas establecidas, pero es uno de los miembros menos estudiados de la familia de transportadores de monocarboxilatos. Por lo tanto, una comprensión mecanística más detallada de este transportador podría abrir nuevas oportunidades terapéuticas y proporcionar la base para futuros estudios para generar herramientas de imágenes in vivo. Los nuevos análogos de MOG que presentamos aquí nos ayudaron a explorar más a fondo la relación estructura-actividad (SAR) entre MCT2 y sus ligandos, más allá de lo que se ha establecido en base a sustratos endógenos19.

Curiosamente, observamos muy poca tolerancia a las sustituciones de α-metilo (4–6), las cuales no alcanzaron nuestro umbral doble para la absorción dependiente de MCT2. Estos tres análogos presentan cierta similitud estructural con el α-cetoisocaproato (Fig. 1d, Fig. 1a complementaria), para el cual MCT2 tiene una Km de 100 µM19. Por lo tanto, su falta de transporte sugiere que MCT2 no puede acomodar la combinación de una sustitución de α-metilo con un grupo éster carboxílico (Fig. 2c, d). Inesperadamente, aunque tampoco observamos ningún transporte dependiente de MCT2 del análogo de cetona (7), este compuesto evitó una disminución inducida por MOG en la respiración celular, lo que sugiere que puede inhibir la actividad de transporte de MCT2 (Fig. 2e). Este hallazgo podría indicar potencialmente que, aunque 7 todavía puede unirse a MCT2, el oxígeno dentro del éster de MOG participa en una interacción dentro del bolsillo de unión del sustrato que se requiere para el transporte.

El transporte dependiente de MCT2 se mantuvo en los ésteres alquílicos más voluminosos. Descubrimos que MCT2 toleró bien el reemplazo del grupo saliente de éster metílico por un éster etílico (2), con un aumento de casi ocho veces en la absorción por parte de las células que expresan MCT2 en comparación con la línea celular de control. El transporte dependiente de MCT2 se mantuvo con una sustitución de éster isopropílico (3); sin embargo, fue menor en comparación con 2, lo que indica que el mayor tamaño de la sustitución condujo a algún impedimento estérico dentro del transportador.

Los heterociclos aromáticos de 5 miembros (8-10) también se transportaron de manera dependiente de MCT2 con un enriquecimiento de entre 2 y 4 veces en las células que expresan MCT2. Dado el creciente interés en el papel de MCT2 en el cáncer22,23,24, este hallazgo proporciona un conjunto útil de estructuras para el desarrollo de ligandos para obtener imágenes de la actividad de MCT2 in vivo.

Incluso en el caso de fármacos muy selectivos, concentraciones intracelulares superiores a las necesarias para alcanzar el objetivo previsto podrían provocar efectos no deseados y toxicidad. Aquí, demostramos que la captación mediada por transportadores determina la concentración intracelular de compuestos y, por lo tanto, dicta su eficacia y toxicidad. Aunque ambos ésteres alquílicos más voluminosos (2, 3) se convierten en NOG intracelularmente, la [NOG]IC alcanzada en células que expresan MCT2 varió ampliamente (48,1, 16,4 y 4,65 mM para MOG, 2 y 3, respectivamente), a pesar de cada análogo dosificándose a la misma concentración. El [NOG]IC logrado por cada compuesto determinó sus efectos dentro de las células, como lo refleja su impacto relativo en la acumulación de masa celular y la apoptosis (Fig. 3a, b). La participación de PHD por 2 y 3 se mantuvo en una variedad de líneas celulares con niveles endógenos y sobreexpresados ​​de MCT2, según la estabilización observada de HIF1α (Fig. 4d, e). De manera similar, los compuestos 2 y 3 solo inhibieron parcialmente la carboxilación reductora y no suprimieron significativamente la producción oxidativa de citrato (Fig. 4c, Fig. complementaria 3c) mediante la inhibición de GDH18; como tal, estos análogos solo agotaron mínimamente los intermedios de TCA en relación con el agotamiento observado cuando se dosifica MOG (Fig. 4a, Fig. Suplementaria 3a). En conjunto, nuestras observaciones sugieren que la falta de citotoxicidad en las células tratadas con 2 y 3 se debe a que estos compuestos dan como resultado un [NOG]IC que no es suficiente para atacar todos los objetivos de NOG que se requieren colectivamente para los efectos celulares observados con MOG.

Dadas las amplias funciones de αKG en las células, se reconoce ampliamente que NOG, como imitador de αKG, es un compuesto promiscuo. Se han realizado importantes esfuerzos para generar compuestos de herramientas y posibles pistas clínicas para inhibir varios de sus objetivos, y en particular las prolil hidroxilasas11, de forma más selectiva. El transporte diferencial de nuestros análogos y las diferencias posteriores en [NOG] IC nos han permitido comprender mejor el mecanismo de acción de (D) MOG. Estudios anteriores implicaron a los PHD en la regulación de la vía mTORC1, en parte al demostrar que DMOG inhibe la actividad de mTORC148. Sin embargo, dado que también se sabe que la glutaminolisis activa mTORC115, las acciones simultáneas de (D)MOG tanto en la glutaminolisis como en la actividad PHD complican estas conclusiones. Aquí demostramos que, si bien el tratamiento de células con MOG conduce a una rápida inhibición de la señalización de mTORC1, los compuestos 2 y 3, que inhiben la actividad de PHD pero no recapitulan los efectos metabólicos de MOG, no pueden inhibir la señalización de mTORC1. En particular, en el músculo, se ha demostrado que PHD1 regula mTORC1 independientemente de su actividad enzimática53. No podemos excluir la posibilidad de que los PHD regulen mTORC1 en otros contextos fisiológicos; sin embargo, nuestros hallazgos sugieren que, en las condiciones experimentales que utilizamos, la inhibición de la actividad enzimática de PHD, por sí sola, es insuficiente para afectar la actividad de mTORC1.

Para las dioxigenasas dependientes de αKG más allá de las PHD, hay muchos menos inhibidores químicos específicos disponibles. Las enzimas TET son de particular interés, dada su función bien establecida en la regulación de la metilación del ADN durante el desarrollo embrionario temprano. Más recientemente, ha quedado claro que estas enzimas también median los efectos del estado metabólico celular sobre la regulación epigenética54,55, lo que, a su vez, puede influir en la diferenciación en el cáncer16. Aún no se han desarrollado inhibidores de TET específicos de isoformas, por lo que se han empleado enfoques basados ​​en "protuberancias y agujeros"56 para permitir la focalización de isoformas individuales a través de isoformas enzimáticas diseñadas con sitios activos expandidos que pueden acomodar análogos de NOG más voluminosos57. Especulamos que nuestro trabajo podría ayudar en la creación de derivados permeables a las células de estos análogos de NOG, permitiendo el estudio de enzimas TET específicas tanto en células como potencialmente también in vivo.

Finalmente, para permitir el estudio de interacciones específicas de MCT2, nuestros análogos fueron diseñados para imitar MOG. Sin embargo, nuestros hallazgos también podrían ser útiles, de manera más general, para los numerosos laboratorios que utilizan DMOG como herramienta. Un mayor desarrollo del compuesto 3 con análogos que también presentan grupos éster de oxoacetato carboxílico más voluminosos probablemente mejorará la estabilidad de la sangre mientras se mantiene la permeabilidad general de la membrana, mejorando así aún más el perfil farmacocinético de este compuesto herramienta.

Consulte Métodos complementarios.

Las células HCC1569, MCF7, LN229 y SN12C se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, 31840) que contenía 10 % de suero fetal de ternera (FCS), glutamina 2 mM y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, y se incubaron en una incubadora humidificada a 37 °C y 5 % de CO2. Todas las líneas celulares se probaron libres de micoplasma y la identidad se confirmó mediante perfiles de repetición corta en tándem (Plataforma de tecnología científica de servicios celulares del Instituto Francis Crick). La generación de células que sobreexpresan HCC1569-MCT2 se logró mediante la transducción retroviral de células HCC1569 con un vector pBabe-puro que contiene la secuencia de ADNc de SLC16A7, como se describió anteriormente18. Se utilizaron como controles células HCC1569-EV transducidas con un vector pBabe-puro vacío.

Las células en placas de cultivo celular se lavaron dos veces con PBS, antes de rasparlas en tampón de muestra SDS (sin beta-mercaptoetanol ni azul de bromofenol) y se hirvieron durante 5 minutos a 95 °C. La proteína se cuantificó mediante un ensayo BCA antes de agregar beta-mercaptoetanol y azul de bromofenol y resolver mediante SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia, antes de bloquearlas con leche al 5% en solución salina tamponada con Tris (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM) que contenía Tween 20 al 0,05% (TBS-T). Luego, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, se lavaron con TBS-T y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a temperatura ambiente en TBS-T de leche al 5%. Los anticuerpos se visualizaron mediante quimioluminiscencia y se obtuvieron imágenes utilizando un Amersham Imagequant 600 RGB.

Los anticuerpos primarios utilizados se obtuvieron de Cell Signaling Technology: P-S6 quinasa nº 9234 1:1000, S6 quinasa nº 2708 1:2000, LDHA: nº 2012 1:1000, PKM2 nº 3198 1:1000; Sigma: β-actina A5316 1:1000; BD Biosciences: HIF1α #610959 1:250; MCT2 1:500 (generado por el laboratorio de Anastasiou). Los anticuerpos secundarios fueron IgG de cabra anti-conejo o anti-ratón de Millipore (#AP132P, #AP127P respectivamente).

Las versiones sin recortar de todas las transferencias Western utilizadas en este estudio se pueden encontrar en la figura complementaria 4.

La proliferación celular y la apoptosis se midieron en tiempo real utilizando un IncuCyteZoom (Essen Bioscience). Las líneas celulares se sembraron en placas de 96 pocillos con entre 4000 y 9000 células por pocillo (dependiendo de la tasa de crecimiento), en presencia del reactivo de ensayo de apoptosis verde Incucyte Caspase 3/7 (Essen Bioscience, utilizado según las instrucciones del fabricante). Se agregaron análogos de MOG en las dosis indicadas 16 a 20 h después de la siembra. El IncuCyteZoom se programó para obtener imágenes de células (fase y fluorescencia) a intervalos de 3 h, y se utilizó un análisis de imágenes automatizado para determinar la confluencia y el número de células apoptóticas.

El consumo de oxígeno se midió en células INS1 intactas que expresaban de manera estable MCT2 humano o un control de vector vacío utilizando un sistema de electrodos de oxígeno Oroboros Oxygraph-2K (Oroboros Instruments) a 37 °C. Se utilizaron células de una placa de cultivo celular confluente de 10 cm por réplica, por condición. Después de la tripsinización, las células se resuspendieron en solución salina tamponada de Hank (HBSS) y se incubaron con DMSO al 0,1% o 1 mM del análogo indicado durante 30 minutos antes del inicio de la oximetría. En cada condición de tratamiento, después de una medición inicial del consumo de oxígeno basal, se agregaron MOG 0,25 mM a la suspensión celular en la cámara del oxímetro. El consumo de oxígeno se normalizó para el número de células. La inhibición de MCT2 se determinó por la capacidad de los análogos para prevenir una disminución de la respiración celular inducida por MOG.

Las células se sembraron 1 día antes del experimento en placas de 6 cm en medio RPMI (como se describe anteriormente), que contenía FCS dializado (3500 Da MWCO). El medio se reemplazó con fresco en t = −1 h. En t = 0, el medio se reemplazó nuevamente por un medio que contenía [U-13C]-glutamina (2 mM) y el análogo de MOG de interés (1 mM) o DMSO al 0,1% (control de vehículo). El tratamiento con compuestos y el marcaje se llevaron a cabo durante 4 h a menos que se indique lo contrario. Se usaron cuatro o cinco placas de réplicas técnicas por condición y se contaron dos o tres placas adicionales de cada línea celular para usarlas en la normalización de las mediciones de metabolitos. También se registró el diámetro celular para calcular los volúmenes celulares con el fin de determinar las concentraciones intracelulares. El diámetro y el número de células se midieron utilizando un Nexcelcom Bioscience Cellometer Auto T4. Al final del experimento, las placas se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo, antes de inactivar las células con la adición de 725 µl de metanol enfriado con hielo seco. Luego se raspó cada placa sobre hielo y las muestras se transfirieron a un tubo de microcentrífuga que contenía 160 µl de CHCl3 y 180 µl de H2O (que contenía 2 nmol de esciloinositol como estándar interno). Las placas se rasparon una vez más con 725 µl adicionales de MeOH frío, que luego se añadió al tubo de microcentrífuga que contenía el resto de la muestra. Las muestras se sonicaron durante 3 × 8 minutos en un baño de agua y los metabolitos se extrajeron durante la noche a 4 °C. El material precipitado se eliminó mediante centrifugación y las muestras se secaron y resuspendieron posteriormente en MeOH/H2O/CHCl3 3:3:1 (vol/vol/vol) (350 µl en total), para separar los metabolitos polares y apolares en una fase acuosa superior y una fase inferior. fase orgánica, respectivamente.

Las células se incubaron con MOG o análogos de MOG (1 mM) durante 4 h. Luego, las células se lavaron con PBS enfriado con hielo y se extrajeron como se describe para GC-MS anteriormente. Las muestras de las fases polares se diluyeron 50 veces en MeOH/H2O 1:1 (vol/vol) (que contenía [U-13C,15N]-valina 5 µM como estándar interno) y se analizaron mediante LC-MS como se describe a continuación.

Para el análisis GC-MS, se secaron 150 µl de la fase acuosa en un inserto de vial, antes de lavar dos veces con 40 µl de MeOH y secar nuevamente. Las muestras se metoximaron (20 µl de 20 mg/ml de metoxiamina en piridina, temperatura ambiente durante la noche) antes de derivatizar con 20 µl de N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida + 1% de trimetilclorosilano (Sigma, 33148) durante ≥1 h. Se utilizó un sistema GC-MS Agilent 7890B-5977A para realizar el análisis de metabolitos. Se utilizó inyección splitless (temperatura de inyección 270 °C) en una columna DB-5MS + DG de 30 m + 10 m × 0,25 mm (Agilent J&W), utilizando gas portador de helio, en modo de ionización por impacto de electrones (EI). La temperatura inicial del horno fue de 70 °C (2 min) con un aumento posterior a 295 °C a 12,5 °C/min, luego a 320 °C a 25 °C/min (antes de mantener durante 3 min). La identificación y cuantificación de metabolitos se realizó utilizando el software MassHunter Workstation (B.06.00 SP01, Agilent Technologies) o el software MANIC, una adaptación desarrollada internamente del paquete GAVIN58, en comparación con los tiempos de retención, espectros de masas y respuestas de cantidades conocidas de sustancias auténticas. estándares. El etiquetado fraccional de metabolitos individuales se informa después de la corrección por abundancia natural.

El método LC-MS fue adaptado de la ref. 59. Las muestras se inyectaron en un sistema Dionex UltiMate LC (Thermo Scientific) usando una columna ZIC-pHILIC (150 mm × 4,6 mm, partículas de 5 μm) (Merck Sequant). Se usó un gradiente de elución de 15 minutos (80 % de disolvente A a 20 % de disolvente B), seguido de un lavado de 5 minutos (95:5 de disolvente A a disolvente B) y un reequilibrio de 5 minutos; El disolvente A era carbonato de amonio 20 mM en agua (calidad Optima HPLC, Sigma Aldrich) y el disolvente B era acetonitrilo (calidad Optima HPLC, Sigma Aldrich). Caudal, 300 µl/min; temperatura de la columna, 25 °C; volumen de inyección, 10 µl; y temperatura del muestreador automático, 4 °C. La EM se realizó con cambio de polaridad positiva/negativa utilizando un Q Exactive Orbitrap (Thermo Scientific) con una sonda HESI II (ionización por electropulverización calentada). Parámetros MS: voltaje de pulverización, 3,5 kV y 3,2 kV para modos positivo y negativo, respectivamente; temperatura de la sonda, 320 °C; gases envolventes y auxiliares, 30 y 5 unidades arbitrarias, respectivamente; rango de escaneo completo, de 70 a 1050 m/z con configuraciones de objetivo AGC y resolución como "equilibrada" y "alta" (3 × 106 y 70 000), respectivamente. Se utilizó el software Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific) para registrar los datos. Antes del análisis, se realizó una calibración de masas para ambas polaridades ESI utilizando la solución estándar Thermo Scientific Calmix. La estabilidad de la calibración se mejoró mediante la aplicación de la corrección de masa de bloqueo a cada ejecución analítica utilizando contaminantes ubicuos de baja masa. Parámetros de adquisición de monitoreo de reacción en paralelo: resolución, 17.500; objetivo de control de ganancia automática, 2 × 105; tiempo máximo de aislamiento, 100 ms; ventana de aislamiento, m/z 0,4; y energías de colisión, configuradas individualmente en modo de disociación por colisión de alta energía. Se combinaron volúmenes iguales de cada muestra para proporcionar muestras de control de calidad y se analizaron durante todo el proceso, proporcionando así una medición de la estabilidad y el rendimiento del sistema. Se utilizaron los software Xcalibur Qual Browser y Tracefinder 4.1 (Thermo Scientific) para realizar análisis cualitativos y cuantitativos respectivamente, de acuerdo con los flujos de trabajo del fabricante.

Se extrajo sangre de ratones hembra NSG sacrificados de 10 a 12 semanas de edad en tubos heparinizados y se utilizó inmediatamente para experimentos. Para probar la estabilidad, los compuestos se incubaron a una concentración final de 100 µM en sangre (volumen total de 600 µL), se precalentaron a 37 °C. Las muestras se recogieron por triplicado a 0 (el compuesto se agregó a la muestra después de la extracción), 5, 15, 30 y 60 minutos. En el momento indicado se tomaron 30 µl y se añadieron a un tubo sobre hielo que contenía 100 µl de cloroformo, 300 µl de MeOH y 270 µl de H2O. [U13C-15N] valina estaba presente en la fase acuosa a una concentración final de 5 µM. Inmediatamente después de la recolección, las muestras se agitaron y se colocaron en hielo. Una vez recolectadas todas las muestras, se sonicaron durante 3 × 8 minutos y se incubaron durante 1 hora a 4 ° C para permitir que continuara la extracción. Luego, las muestras se centrifugaron (10 min, 4 °C, velocidad máxima) y la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo y se almacenó a -80ºC hasta que estuvieron listas para procesarse en el sistema LC-MS (Q Exactive), como se describió anteriormente. . Las muestras se cuantificaron frente a una curva estándar de 7 puntos del compuesto en el extracto de sangre de ratón para minimizar los efectos de la matriz.

Todos los procedimientos experimentales con ratones se llevaron a cabo de conformidad con la política del servicio de salud pública sobre el cuidado humano y el uso de animales de laboratorio, de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y la Política de GSK sobre el Cuidado, Bienestar y Tratamiento de Animales, aprobada por la Organismo de Revisión Ética y Bienestar Animal del Instituto Francis Crick (AWERB) y cumplir con una licencia para el laboratorio Anastasiou ratificada por el Ministerio del Interior del Reino Unido. A ratones NSG hembras adultos (de 10 a 12 semanas de edad) se les administró mediante inyección intraperitoneal 1 (MOG) o el compuesto 3 a 100 mg/kg. Se recogieron muestras de sangre de la vena safena en un dispositivo de micromuestreo Mitra (10 µl de capacidad, 100601-A, neoteryx) antes de la inyección (t = 0) y a los 15 min, 1 hy 2 h después de la inyección. Al final del experimento, los animales fueron sacrificados mediante dislocación cervical y los tejidos se recolectaron inmediatamente y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlos a -80 °C. Para las muestras de sangre, la punta de 'esponja' del micromuestreador se transfirió a un tubo de microcentrífuga que contenía 33,3 µl de CHCl3, 100 µl de MeOH y se agitó completamente. Se incluyó [U13C-15N]-valina hasta una concentración final de 5 µM en fase acuosa. Las muestras se sonicaron 3 × 8 minutos a 4 ° C en un baño de agua de sonicación y se almacenaron a -80ºC hasta que se necesitaron. Las fases se dividieron mediante la adición de 90 µl de H2O antes de centrifugar a 4 °C a máxima velocidad durante 5 minutos (dado que los análogos de MOG son susceptibles a la hidrólisis acuosa, se añadió H2O inmediatamente antes de ejecutar). La fase acuosa se ejecutó en LC-MS como se describe anteriormente.

El tipo y los números de réplica se indican dentro de la leyenda de cada figura. Los análisis estadísticos a lo largo de este trabajo se realizaron utilizando GraphPad Prism® 7.0bo versiones posteriores. Las comparaciones se realizaron utilizando pruebas t no pareadas, pruebas t múltiples con el método de Holm-Sidak para pruebas de comparación múltiple, ANOVA unidireccional con corrección de Dunnett para comparaciones múltiples o ANOVA bidireccional con la prueba de Tukey para comparaciones múltiples, como se indica en las respectivas leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los resultados que se muestran en la figura complementaria 1b se basan en datos generados por la Red de Investigación TCGA (https://www.cancer.gov/tcga). Los datos de origen subyacentes a los gráficos mostrados en este estudio se proporcionan en Datos complementarios 1. Las versiones sin recortar de las transferencias Western utilizadas en este estudio (Figs. 2b, 4d, 4e y Fig. 3d complementaria) se pueden encontrar en la Fig. 4 complementaria.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03922-8

Woolley, DW La revolución en farmacología. Perspectiva. Biol. Med 1, 174-197 (1958).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Méndez-Lucas, A. et al. Identificar estrategias para abordar la flexibilidad metabólica de los tumores. Nat. Metab. 2, 335–350 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, X. y col. La regulación del transportador de cistina de la dependencia de la vía de las pentosas fosfato y el estrés por disulfuro expone una vulnerabilidad metabólica abordable en el cáncer. Nat Cell Biol 22, 476–486 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lu, H. y col. La combinación racional con la inhibición de PDK1 supera la resistencia a cetuximab en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. Jci Insight 4, e131106 (2019).

Artículo PubMed Central Google Scholar

Luengo, A., Gui, DY & Heiden, MGV Dirigido al metabolismo para la terapia del cáncer. Química celular. Biol. 24, 1161-1180 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bobrovnikova-Marjon, E. & Hurov, JB Dirigirse a los cambios metabólicos en el cáncer: nuevos enfoques terapéuticos. Medicina 65, 157-170 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Hamada, S. y col. Síntesis y actividad de N-oxalilglicina y sus derivados como inhibidores de histona lisina desmetilasa que contienen el dominio C de Jumonji. Bioorg. Química médica. Letón. 19, 2852–2855 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jaakkola, P. y col. Dirigido a HIF-alfa al complejo de ubiquitilación von Hippel-Lindau mediante hidroxilación de prolil regulada por O2. Ciencia 292, 468–472 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Amouroux, R. y col. La metilación de novo del ADN impulsa la acumulación de 5 hmC en cigotos de ratón. Nat. Biol celular. 18, ncb3296 (2016).

Artículo de Google Scholar

Iván, M. et al. HIFalpha dirigido a la destrucción mediada por VHL mediante hidroxilación de prolina: implicaciones para la detección de O2. Ciencia 292, 464–468 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chan, MC, Holt-Martyn, JP, Schofield, CJ y Ratcliffe, PJ Orientación farmacológica de las hidroxilasas HIF: un nuevo campo en el desarrollo de medicamentos. Mol. Áspid. Medicina 47–48, 54–75 (2016).

Artículo de Google Scholar

Eltzschig, HK, Bratton, DL y Colgan, SP Dirigirse a la señalización de hipoxia para el tratamiento de enfermedades isquémicas e inflamatorias. Nat. Rev.Droga Disco. 13, 852–869 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Cummins, EP y cols. El inhibidor de la hidroxilasa dimetiloxalilglicina tiene un efecto protector en un modelo murino de colitis. Gastroenterología 134, 156–165.e1 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Milkiewicz, M., Pugh, CW y Egginton, S. La inhibición de la inactivación endógena de HIF induce la angiogénesis en músculos esqueléticos isquémicos de ratones. J. Physiol. 560, 21-26 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Durán, RV et al. La glutaminolisis activa la señalización de Rag-mTORC1. Mol. Celda 47, 349–358 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Morris, JP y cols. El α-cetoglutarato vincula p53 con el destino celular durante la supresión tumoral. Naturaleza 573, 595–599 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shahmirzadi, AA y cols. El alfa-cetoglutarato, un metabolito endógeno, prolonga la vida útil y comprime la morbilidad en ratones que envejecen. Metabolismo celular. 32, 447–456.e6 (2020).

Artículo de Google Scholar

Fets, L. et al. MCT2 media la inhibición dependiente de la concentración del metabolismo de la glutamina por parte de MOG. Nat. Química. Biol. 14, 1-18 (2018).

Artículo de Google Scholar

BRÖER, S. et al. Caracterización del transportador de monocarboxilato de alta afinidad MCT2 en ovocitos de Xenopus laevis. Biochem J. 341, 529 (1999).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Pellerin, L., Halestrap, AP y Pierre, K. Distribución celular y subcelular de transportadores de monocarboxilato en células cerebrales cultivadas y en el cerebro adulto. J Neurosci Res. 79, 55–64 (2004).

Artículo de Google Scholar

Mächler, P. et al. Evidencia in vivo de un gradiente de lactato de astrocitos a neuronas. Metab celular 23, 94-102 (2015).

Artículo PubMed Google Scholar

Pértega-Gomes, N. et al. Transportador de monocarboxilato 2 (MCT2) como biomarcador putativo en el cáncer de próstata. Próstata 73, 763–769 (2012).

Artículo PubMed Google Scholar

Huang, C.-K. et al. Los adipocitos promueven el crecimiento maligno de tumores de mama con la expresión del transportador de monocarboxilato 2 a través de β-hidroxibutirato. Nat. Comunitario. 8, 1-13 (2017).

Google Académico

Elia, I. et al. Las células de cáncer de mama dependen del piruvato ambiental para dar forma al nicho metastásico. Naturaleza 568, 1–5 (2019).

Artículo de Google Scholar

Rautio, J. et al. Profármacos: diseño y aplicaciones clínicas. Nat. Rev.Droga Disco. 7, 255–270 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Huttunen, KM, Raunio, H. & Rautio, J. Profármacos: de la casualidad al diseño racional. Farmacéutica. Rev. 63, 750–771 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zawilska, J.B., Wojcieszak, J. & Olejniczak, AB Prodrugs: un desafío para el desarrollo de fármacos. Farmacéutica. Reps. 65, 1-14 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Jornada, D. et al. El enfoque de los profármacos: una herramienta exitosa para mejorar la solubilidad de los fármacos. Moléculas 21, 42 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Stoeckel, K. y col. Estabilidad de los ésteres de profármacos de cefalosporina en el jugo intestinal humano: implicaciones para la biodisponibilidad oral. Antimicrobiano. Agentes Capítulo 42, 2602–2606 (1998).

Artículo CAS Google Scholar

Barton, P., Laws, AP y Page, MI Relaciones estructura-actividad en la hidrólisis catalizada por esterasa y la transesterificación de ésteres y lactonas. J. química. Soc. Perkin Trans. 20, 2021-2029 (1994).

Artículo CAS Google Scholar

Talath, S., Shirote, P., Lough, W. y Gadad, A. Estudios de estabilidad de algunos profármacos de éster de glicolamida del ácido niflúmico en tampones acuosos y plasma humano mediante HPLC con detección UV. Arzneimittelforschung 56, 631–639 (2011).

Artículo de Google Scholar

JOHANSEN, M. & LARSEN, C. Comparación de la estabilidad química y la hidrólisis enzimática de una serie de derivados éster alifáticos y aromáticos de metronidazol. Int J. Pharm. 26, 227–241 (1985).

Artículo CAS Google Scholar

Seki, H., Kawaguchi, T. & Higuchi, T. Especificidad de las esterasas y estructura de los ésteres de profármacos: reactividad de varios compuestos de paracetamol acilados y compuestos acetilaminobenzoados. J. Farmacéutica. Ciencia. 77, 855–860 (1988).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bender, DM y cols. Ésteres de ácido ciclopropanocarboxílico como posibles profármacos con estabilidad hidrolítica mejorada. Org. Letón. 10, 509–511 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Tian, ​​L. y col. Par selectivo de esterasa-éster para apuntar a moléculas pequeñas con especificidad celular. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. 109, 4756–4761 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lavis, LD Ester se une a los profármacos. Acs Química. Biol. 3, 203–206 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Yamazaki, Y., Kageyama, Y. y Okuno, H. Evaluación directa de la estereoselectividad de las esterasas cancerosas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida junto con tinción de actividad con ésteres de naftilo quirales. Anal. Bioquímica 231, 295–300 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Meanwell, NA Sinopsis de algunas aplicaciones tácticas recientes de bioisósteros en el diseño de fármacos. J. Med Chem. 54, 2529–2591 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nassar, A.-EF, Kamel, AM y Clarimont, C. Mejora del proceso de toma de decisiones en la modificación estructural de fármacos candidatos: mejora de la estabilidad metabólica. Discoteca de drogas. Hoy 9 de 1020-1028 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Barlow, RB, Bremner, JB & Soh, KS Los efectos de reemplazar el éster por amida en las propiedades biológicas de los compuestos relacionados con la acetilcolina. Brit J. Pharm. 62, 39–50 (1978).

Artículo CAS Google Scholar

Patani, GA & LaVoie, EJ Bioisosterismo: un enfoque racional en el diseño de fármacos. Química. Rev. 96, 3147–3176 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Diana, GD y cols. Oxadiazoles como sustitutos bioisostéricos de ésteres en compuestos relacionados con el disoxarilo. actividad antirinovirus. J. Med Chem. 37, 2421–2436 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Street, LJ y cols. Síntesis y actividad biológica de derivados de 1,2,4-oxadiazol: agonistas muy potentes y eficaces de los receptores muscarínicos corticales. J. Med Chem. 33, 2690–2697 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bach, P. y col. Los derivados de 5-alquil-1,3-oxazol de los ácidos 6-aminonicotínicos como bioisósteros de ésteres alquílicos son antagonistas del receptor P2Y12. Química médica del futuro. 5, 2037-2056 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Brouwer, KLR y cols. Métodos in vitro para apoyar la evaluación de transportadores en el descubrimiento y desarrollo de fármacos. Clínico. Farmacéutica. El r. 94, 95-112 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Sekine, N. y col. Lactato deshidrogenasa baja y glicerol fosfato deshidrogenasa mitocondrial alta en células beta pancreáticas. Papel potencial en la detección de nutrientes. J. Biol. Química. 269, 4895–4902 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ovens, MJ, Davies, AJ, Wilson, MC, Murray, CM & Halestrap, AP AR-C155858 es un potente inhibidor de los transportadores de monocarboxilato MCT1 y MCT2 que se une a un sitio intracelular que involucra las hélices transmembrana 7-10. Biochem J. 425, 523–530 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Durán, RV et al. Papel independiente de HIF de las prolil hidroxilasas en la respuesta celular a los aminoácidos. Oncogén 32, 4549–4556 (2013).

Artículo PubMed Google Scholar

Kato, S., Takahashi, T., Miyata, N. & Roman, RJ DMOG, un inhibidor de la prolil hidroxilasa, aumenta los niveles de hemoglobina sin exacerbar la hipertensión y la lesión renal en ratas hipertensas sensibles a la sal. J. Farmacéutica. Exp. El r. 372, 166-174 (2019).

Artículo de Google Scholar

Dirscherl, K. y col. La detección de hipoxia por parte de las células estrelladas hepáticas conduce a una angiogénesis dependiente de VEGF y puede contribuir a la regeneración acelerada del hígado. Ciencia. Rep.-Reino Unido 10, 4392 (2020).

Artículo de Google Scholar

Ogle, ME, Gu, X., Espinera, AR y Wei, L. La inhibición de las prolil hidroxilasas por dimetiloxaloilglicina después de un accidente cerebrovascular reduce la lesión cerebral isquémica y requiere el factor 1α inducible por hipoxia. Neurobiol. Dis. 45, 733–742 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Nagamine, Y. y col. La inhibición de la prolil hidroxilasa atenúa la apoptosis inducida por el ligando fas y la lesión pulmonar en ratones. Soy. J. Resp. Molino celular. 55, 878–888 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

D'Hulst, G. et al. PHD1 controla el mTORC1 muscular de una manera independiente de la hidroxilación mediante la estabilización de la leucil ARNt sintetasa. Nat. Comunitario. 11, 174 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Carey, BW, Finley, LWS, Cross, JR, Allis, CD y Thompson, CB El α-cetoglutarato intracelular mantiene la pluripotencia de las células madre embrionarias. Naturaleza 518, 413 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Schvartzman, JM, Thompson, CB y Finley, LWS Regulación metabólica de las modificaciones de la cromatina y la expresión genética. J. Biol celular. 217, jcb.201803061 (2018).

Artículo de Google Scholar

Islam, K. La táctica del golpe y el agujero: ampliar el alcance de la genética química. Química celular. Biol. 25, 1171-1184 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sudhamalla, B. y col. Ingeniería estérica complementaria en la interfaz proteína-ligando para oxigenasas TET sensibles a análogos. Mermelada. Química. Soc. 140, 1–7 (2018).

Artículo de Google Scholar

Behrends, V., Tredwell, GD & Bundy, JG Un complemento de software para AMDIS para procesar datos metabolómicos de GC-MS. Anal. Bioquímica 415, 206–208 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhang, T., Creek, DJ, Barrett, MP, Blackburn, G. y Watson, DG Evaluación del acoplamiento de cromatografía líquida de fase reversa, fase normal acuosa e interacción hidrófila con espectrometría de masas Orbitrap para estudios metabolómicos de orina humana. Anal. Química. 84, 1994-2001 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

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Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de DA por las valiosas discusiones y aportes a lo largo de este trabajo, a los miembros del laboratorio de LF por la lectura crítica del manuscrito y al equipo de traducción de Crick por las útiles discusiones. El laboratorio de LF está financiado por el MRC (MC-A654-5QC70). Este trabajo fue financiado por el MRC (MC_UP_1202/1) y por el Instituto Francis Crick, que recibe su financiación principal de Cancer Research UK (FC001033), el UK Medical Research Council (FC001033) y Wellcome Trust (FC001033) para DA For the Para fines de acceso abierto, los autores han aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de este envío.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Instituto Francis Crick.

Louise Fets

Dirección actual: Laboratorio de Transporte de Fármacos y Metabolismo Tumoral, Instituto de Ciencias Médicas de Londres MRC, Londres, Reino Unido

Estos autores contribuyeron igualmente: Natalie Bevan, Patrícia M. Nunes.

Laboratorio de Metabolismo del Cáncer, Instituto Francis Crick, Londres, Reino Unido

Louise Fets, Natalie Bevan, Patrícia M. Nunes y Dimitrios Anastasiou

Crick–GSK Biomedical LinkLabs, Londres, Reino Unido

Sebastien Campos, Emma Sherriff y David House

Plataforma Tecnológica Científica de Metabolómica, Instituto Francis Crick, Londres, Reino Unido

Mariana Silva dos Santos y James I. MacRae

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SC y DH diseñaron (con aportes de LF y DA) y sintetizaron análogos de MOG, y asesoraron sobre el diseño experimental de dosificación en ratones; NB ayudó con el trabajo de líneas celulares y transferencias Western relacionadas y realizó experimentos de respiración celular junto con PN; La PN también ayudó con la dosificación del compuesto en ratones; ES ayudó y asesoró sobre las mediciones de estabilidad de los compuestos; MSdS y JIM ayudaron y asesoraron sobre experimentos de metabolómica; LF diseñó y realizó todos los demás experimentos, analizó e interpretó datos. DA supervisó el estudio, diseñó experimentos e interpretó datos. LF escribió el primer borrador del manuscrito y lo desarrolló con el apoyo de DA y el aporte de SC y DH. Todos los autores revisaron y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Dimitrios Anastasiou.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Sonam Kumari, Shijie Cai y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Toril Holien y Eve Rogers. Los informes de los revisores pares están disponibles.

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Fets, L., Bevan, N., Nunes, PM et al. Análogos de MOG para explorar el farmacóforo MCT2, la biología del α-cetoglutarato y los efectos celulares de la N-oxalilglicina. Común Biol 5, 877 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03805-y

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Recibido: 03 de marzo de 2021

Aceptado: 05 de agosto de 2022

Publicado: 26 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03805-y

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