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Jun 23, 2023

Flexibilidad conformacional en la neutralización del SARS

Communications Biology volumen 5, Número de artículo: 789 (2022) Cita este artículo 23k Accesos 2 Citas 775 Detalles de Altmetric Metrics A medida que siguen surgiendo nuevas variantes del SARS-CoV-2, es importante

Biología de las comunicaciones volumen 5, número de artículo: 789 (2022) Citar este artículo

23k Accesos

2 citas

775 altmétrico

Detalles de métricas

A medida que siguen surgiendo nuevas variantes del SARS-CoV-2, es importante evaluar las capacidades de neutralización cruzada de los anticuerpos provocados naturalmente durante la infección por el SARS-CoV-2 de tipo salvaje. En el presente estudio, evaluamos la actividad de nueve anticuerpos monoclonales (mAb) anti-SARS-CoV-2, previamente aislados de donantes convalecientes infectados con la cepa Wuhan-Hu-1, contra las variantes preocupantes del SARS-CoV-2 ( COV) Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron. Al probar una variedad de proteínas del dominio de unión al receptor de picos (RBD) mutadas, proteínas de pico expresadas en células de COV y la neutralización de COV del SARS-CoV-2 como pseudovirus o como virus auténticos en cultivo, demostramos que los mAb dirigidos contra el El sitio de unión de ACE2 (ACE2bs) es más sensible a la evolución viral en comparación con los mAb anti-RBD distintos de ACE2bs, dos de los cuales conservan su potencia contra todos los VOC analizados. En la segunda parte de nuestro estudio, revelamos los mecanismos de neutralización a alta resolución molecular de dos mAb neutralizantes anti-SARS-CoV-2 mediante caracterización estructural. Resolvemos las estructuras del mAb ACE2bs TAU-2303 que neutraliza Delta con el trímero de pico del SARS-CoV-2 y RBD con resoluciones de 4,5 Å y 2,42 Å, respectivamente, lo que revela un modo de unión similar al de RBD y ACE2. Además, proporcionamos cinco estructuras adicionales (con resoluciones de 4,7 Å, 7,3 Å, 6,4 Å, 3,3 Å y 6,1 Å) de un segundo anticuerpo, TAU-2212, formando complejo con el trímero de pico del SARS-CoV-2. TAU-2212 se une a un epítopo exclusivamente cuaternario y exhibe un modo de neutralización único y flexible que implica la transición entre cinco conformaciones diferentes, con ambos brazos del anticuerpo reclutados para reticular subunidades RBD intra e interpicos. Nuestro estudio proporciona una comprensión mecanística adicional sobre cómo los anticuerpos neutralizan el SARS-CoV-2 y sus variantes emergentes y proporciona información sobre la probabilidad de reinfecciones.

Dos años después de la aparición del coronavirus SARS 2 (SARS-CoV-2) en la provincia de Wuhan, la cepa del virus original ha sido completamente reemplazada por variantes más transmisibles, y Omicron emerge como la última variante preocupante (VOC). En vista de las tasas inesperadamente rápidas de evolución viral, es importante estimar el grado en que los anticuerpos neutralizantes provocados naturalmente después de la infección con la cepa original de tipo salvaje (Wuhan-Hu-1) tienen reactividad cruzada con los anticuerpos circulantes, presentes y futuros. COV. Esto es particularmente relevante teniendo en cuenta informes recientes de que la vacunación proporciona una protección considerablemente menor contra las variantes del SARS-CoV-2 que contra la cepa original1,2,3.

La respuesta de los anticuerpos contra el SARS-CoV-2 se ha perfilado a nivel secuencial, estructural y mecanístico mediante la clonación y caracterización de anticuerpos monoclonales (mAb) de donantes convalecientes infectados con Wuhan-Hu-14,5,6,7,8,9. Sin embargo, con la aparición de variantes, muchos de estos mAb, algunos de los cuales han sido aprobados para el tratamiento de pacientes con COVID-1910,11,12, se han vuelto ineficaces13,14,15, mientras que otros conservan actividad16. Esto indica que algunos anticuerpos provocados por la infección son más sensibles a la variación que otros, y que se debe considerar la amplitud de la especificidad de los anticuerpos, y no solo la potencia. Por lo tanto, se necesita una investigación de resolución más precisa de la base mecanicista y funcional de la neutralización de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 para predecir el efecto que tendrán las modificaciones virales en la actividad de los anticuerpos y estimar el grado de protección contra la reinfección y la infección irruptiva por el SARS-CoV-2. . Además, el estudio del reconocimiento molecular de anticuerpos neutralizantes provocados naturalmente en el contexto de virus heterólogos puede revelar sitios con una menor tendencia a la variación.

Anteriormente identificamos un panel de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 derivados de dos sobrevivientes de COVID-19 que fueron infectados en Israel en marzo de 2020, probablemente con la cepa Wuhan-Hu-19. Siete de estos mAb (TAU-1109, -1145, -2189, -2212, -2230, -2303 y -2310) exhibieron una potente actividad neutralizante del SARS-CoV-2, mientras que la actividad de otros dos (TAU-1115 y TAU -2220) fue menos potente. Todos los mAb, excepto uno, se unen al dominio de unión al receptor soluble (RBD) y se unen con alta afinidad. La excepción, TAU-2212, que es uno de los mAb neutralizantes más potentes, se une a una superficie conformacional desconocida y la unión solo se puede detectar cuando la proteína de pico se expresa en partículas o células virales. Si bien exhiben actividad neutralizante contra la cepa Wuhan-Hu-1, se desconoce la reactividad cruzada de estos mAb con los COV del SARS-CoV-2.

El presente estudio fue diseñado para investigar la amplitud de la especificidad y la base estructural de la actividad neutralizante de nuestros mAb previamente aislados, en el contexto de las variantes emergentes Alfa (B.1.1.7)17, Beta (B.1.351)18, Gamma. (P.1 o B.1.1.28.1)19, Delta (B.1.617.2)20,21 y Omicron (B.1.1.529)22. Los resultados indican que los mAb más potentes de nuestro panel están dirigidos predominantemente contra el supersitio del sitio de unión ACE2 (ACE2bs) y también son los más sensibles a la diversificación viral. Para comprender la base de la neutralización y el escape a nivel atómico, utilizamos microscopía crioelectrónica (crioEM) y cristalografía de rayos X para determinar las estructuras de los dos mAb: TAU-2303 y TAU-2212. Los resultados indican que la interacción de TAU-2303 Fab y SARS-CoV-2 RBD se parece a la del receptor ACE2 con RBD en la conformación "arriba" de RBD. Por el contrario, el mAb TAU-2212 exhibe un tipo de unión de flexibilidad de reconocimiento inusual que involucra cinco conformaciones posibles diferentes, con 1 a 3 Fabs uniéndose a un trímero de espiga, o reticulando trímeros adyacentes formando contactos intra e inter-espiga, y favoreciendo a RBD en la posición "abajo". Nuestro estudio proporciona importantes conocimientos mecanicistas y estructurales sobre la neutralización de los COV del SARS-CoV-2 mediante anticuerpos naturales, junto con predicciones de modelos moleculares de las interacciones de mAb con la variante Omicron.

Los resultados de nuestro estudio anterior indicaron que los mAb TAU-1145, -2189, -2230 y -2303 compiten con ACE2 y, por lo tanto, se definen como mAb ACE2bs, mientras que los mAb TAU-1109, -1115, -2220, -2310 no compiten con ACE2 y, por lo tanto, se definen como no ACE2bs9. El último mAb neutralizante, TAU-2212, no se une a los antígenos solubles del SARS-CoV-2 (RBD o pico) mediante ELISA y reconoce un epítopo desconocido9. Para examinar el reconocimiento de los RBD de los COV del SARS-CoV-2 por parte de nuestros mAb previamente aislados, generamos proteínas RBD solubles que contienen las mutaciones identificadas en las cepas Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron (Tabla complementaria 1) y probamos la unión. por los ocho mAb que originalmente exhibieron una fuerte unión a la cepa de tipo salvaje RBD9. Con la excepción de Alpha, observamos una reducción en la eficiencia de unión de los mAb ACE2bs a todos los COV (Fig. 1a y Fig. 1 complementaria). Esto fue más significativo para los RBD Beta, Delta y Omicron, pero también estuvo presente, aunque en menor medida, para la variante Gamma. Entre los mAb ACE2bs, sólo TAU-2303 mantuvo su actividad original contra la cepa Delta. TAU-2212 no se une a RBD soluble y no se pudo evaluar utilizando este ensayo9. Para investigar la contribución individual de cada mutación, generamos RBD que albergan sustituciones de aminoácidos simples o dobles correspondientes a las variantes Beta, Gamma y Delta. De los ocho RBD de mutación única probados, las sustituciones L452R (presente en Delta VOC23) y E484K (presente en Beta y Gamma VOC24) tuvieron un impacto importante en la unión de anticuerpos (Fig. 1b, d y Fig. 1 complementaria). ). Otras sustituciones simples, sin embargo, no tuvieron efecto sobre la unión de mAb. Además, los RBD que contienen mutaciones únicas N439K25, Y453F26,27 y A475V28, que se han informado en algunas cepas circulantes de SARS-CoV-2, se unieron a todos los mAb con tanta fuerza como el RBD de tipo salvaje original. Curiosamente, la unión del mAb TAU-2303 al doble mutante K417N/N501Y se redujo aunque cada uno de los dos mutantes individuales por separado no tuvo ningún efecto (Fig. 1c, d y Fig. 1 complementaria). En general, llegamos a la conclusión de que los mAb ACE2bs son más sensibles a las mutaciones en los RBD que los mAb no ACE2bs.

Los anticuerpos ACE2bs o no ACE2bs se indican a la izquierda de cada panel, a–d. Para los paneles a-c, cada gráfico representa la unión de anticuerpos a RBD mutante de tipo salvaje o VOC (a), simple (b) o doble (c). El AUC fue calculado por GraphPad Prism. Los valores brutos de OD650, así como el control de isotipo, se presentan en la figura complementaria 1. Cada experimento se repitió al menos tres veces (n ≥ 3). d Resumen de la afinidad de unión del anticuerpo a cada RBD generado en este estudio. El color verde indica una afinidad de unión de >75 %, el naranja de 25–75 % y el amarillo de <25 % en comparación con el RBD de tipo salvaje. Se indican los COV que albergan cada mutación.

Las mutaciones fuera de RBD también pueden afectar la actividad de los mAb que se unen a RBD al alterar la organización conformacional del trímero29. Por lo tanto, a continuación expresamos la proteína de pico de longitud completa de las variantes de tipo salvaje, Alfa, Beta y Delta (Tabla complementaria 1) en células Expi293F y analizamos la capacidad de cada mAb para inhibir la unión de ACE2 humana soluble (hACE2) mediante flujo. citometría. La proteína de pico Gamma de longitud completa no se produjo ya que el RBD de esta variante exhibió una actividad similar a la del RBD Beta. Como se esperaba, la mayoría de los mAb ACE2bs inhibieron eficazmente las interacciones ACE2:spikewild y ACE2:spikeAlpha, pero no aquellas entre ACE2:spikeBeta y ACE2:spikeDelta. El mAb TAU-2212, que se puede probar en este ensayo, demostró una inhibición de ACE2: pico del 25 al 40% cuando se probó contra las cepas de tipo salvaje, Alfa y Delta, pero no tuvo actividad contra Beta (Fig. 2a, b y Fig. Suplementaria). .2). De hecho, ninguno de los mAb ACE2bs conservó su potencia original contra la variante Beta y, de acuerdo con los datos de ELISA, solo el mAb TAU-2303 conservó su actividad completa contra la variante Delta. Como era de esperar, no se observó ningún efecto para los mAb TAU-1109, -2310, -1115 y -2220, ya que la neutralización no actúa mediante el bloqueo del receptor.

a Gráficos de citometría de flujo que demuestran la eficacia de cada mAb cuando interfiere con la unión de pico:ACE2 (consulte la figura complementaria 2 para obtener más detalles). Se transfectaron células Expi293F para expresar el pico de tipo salvaje, Alfa, Beta o Delta, y se incubaron con cada anticuerpo, antes de teñirlas con ACE2 humana (hACE2) conjugada con APC. Se utilizó hACE2 sin marcar (hACE2 “fría”) como control positivo y el anticuerpo mGO5366 como control de isotipo. Dentro de cada gráfico, el histograma azul indica células tratadas, mientras que el rojo indica no tratadas. Cada experimento se repitió al menos tres veces (n ≥ 3). b Porcentaje normalizado de pico: inhibición de ACE2, calculado midiendo el porcentaje de células positivas para hACE2-APC en presencia de cada mAb, dividiéndolo por el porcentaje de células positivas para hACE2-APC (solo hACE2) y normalizándolo al 100 %. c Gráficos circulares que indican la frecuencia de pico: mAb inhibidores de ACE2 para tipo salvaje y COV.

Luego evaluamos la capacidad de los mAb para prevenir infecciones. Empleamos un ensayo de neutralización pseudoviral y una infección de células Vero-TMPRSS2 con SARS-CoV-2 auténtico para probar la actividad de los nueve mAb contra el SARS-CoV-2 de tipo salvaje y los COV (Fig. 3). De acuerdo con los resultados de ELISA y citometría de flujo, Alpha VOC se comportó de manera similar a la cepa de tipo salvaje, mientras que las variantes Beta y Omicron fueron las más resistentes, seguidas de Gamma y Delta. De acuerdo con los resultados de ELISA y citometría de flujo, el mAb TAU-2303 fue el único mAb ACE2bs que pudo neutralizar el Delta VOC, con una potencia mejorada en comparación con la cepa de tipo salvaje (Fig. 3a). Los mAb no ACE2bs TAU-1109 y -2310 conservaron su eficacia contra todos los COV probados, y TAU-2310 mostró una actividad mejorada contra la variante Delta en comparación con el tipo salvaje (Fig. 3a, b). Estos resultados indican un papel de apoyo crucial para los mAb distintos de ACE2bs en presencia de mutaciones virales que previenen la neutralización por los mAb ACE2bs. Además, la actividad mejorada de los mAb TAU-2310 y TAU-2303 demuestra cómo la variación genética en un COV del SARS-CoV-2 puede aumentar la neutralización de algunas clases de mAb.

a Curvas de neutralización de anticuerpos de partículas virales reporteras de GFP pseudotipadas de tipo salvaje, Alfa, Beta y Delta VOC. Para cada mAb, cada curva representa la inhibición de un COV como se indica. Los anticuerpos se preincubaron con partículas virales en 8 diluciones triples consecutivas comenzando con 10 µg/ml de anticuerpo. La fluorescencia de las células infectadas se leyó 72 h después de la infección. El porcentaje de inhibición se calculó normalizando a células no tratadas. Cada experimento se realizó por triplicado (n = 3). Se utilizó mGO53 como control de isotipo. Las barras de error indican SD. b Infección de células Vero-TMPRSS2 de tipo salvaje (n = 4), Alfa (n = 2), Beta (n = 4), Gamma (n = 4), Delta y Omicron (n = 6) con SARS-CoV auténtico -2 y recubierto con carboximetilcelulosa. Los valores se expresan como el área de superficie infectada de las células y se normalizan para células infectadas sin mAb. Las partículas virales se preincubaron con 100 µg/ml de anticuerpo durante 1 h antes de su adición a las células. Las células infectadas se identificaron 24 h después de la infección utilizando el anticuerpo de la nucleocápside del SARS-CoV-2 después de la fijación y permeabilización celular. Las células infectadas se cuantificaron utilizando Incucyte S3. mGO53 sirve como control de isotipo. Las barras de error indican SD.

La evolución viral parece centrarse principalmente en el supersitio ACE2bs, lo que coincide con la potencia superior general de los mAb bloqueadores de receptores para inhibir el SARS-CoV-2. Decidimos centrarnos en el mAb TAU-2303, que es el único mAb ACE2bs que es activo contra Delta VOC, y el mAb TAU-2212 que bloquea la unión al receptor mediante el reconocimiento de una superficie conformacional, e investigar más a fondo la base estructural de la neutralización de estos. dos mAb. Primero determinamos la estructura crioEM del fragmento de unión al antígeno (Fab) de TAU-2303 (Fab2303) en complejo con el trímero de pico ecto SARS-CoV-2, a una resolución de 4,5 Å (Fig. 4a). La estructura crioEM reveló que una molécula Fab2303 se une a un trímero de punta en el RBD que sobresale hacia arriba. Por lo tanto, el mAb TAU-2303 se puede clasificar como un mAb de tipo CoV2130, que pertenece a los mAb de unión a RBD de clase 1 y se une solo a una subunidad de RBD entre las tres subunidades disponibles del trímero (Fig. 4a). También cristalizamos Fab2303 en complejo con SARS-CoV-2 RBD y analizamos la estructura con una resolución de 2,42 Å (Fig. 4b, Tabla 1). Los resultados de las estructuras cristalina y crioEM indicaron que el complejo Fab2303-RBD tiene una gran superficie enterrada de 1185 Å2, con la mayor parte de la superficie de contacto (64%) derivada de la cadena pesada de Fab2303, y solo el 36% de la cadena ligera. cadena. Un total de 29 residuos de RBD en la estructura cristalina tienen contactos estrechos directos con Fab2303 (Tabla complementaria 2). De acuerdo con el análisis de la superficie de contacto, 19 de estos residuos son de la cadena pesada (HC), mientras que 10 son de la cadena ligera (LC) de TAU-2303. Los residuos de contacto median la formación de 23 enlaces de hidrógeno (Tabla complementaria 2). Estos incluyen cinco enlaces de hidrógeno RBD-D420OD2 - Fab2303-HC-S56OG, RBD-Y473OH - Fab2303-HC-S31O, RBD-T415OG1 - Fab2303-HC-Y58OH, RBD-L455O - Fab2303-HC-Y33OH y RBD-Q493NE2 - Fab2303-HC-Y102OH con distancias inferiores a 2,7 Å (Tabla complementaria 2). De acuerdo con la bioquímica y los ensayos celulares in vitro, 14 (K417, T453, L455, A475, F486, N487, Y489, Q493, G496, Q498, T500, N501, G502 e Y505) de los 29 contactos entre Fab2303 y RBD , también participan en la unión del receptor ACE2, lo que confirma que TAU-2303 neutraliza el virus al bloquear la unión del receptor (Figs. 1-3, 4b y Figs. complementarias 1,2). El ángulo de aproximación a través del cual Fab2303 se une a RBD es de 25 ° con respecto al de ACE2 (Fig. 4b). Comparaciones adicionales revelaron que el modo de unión del mAb TAU-2303 es similar al de otros anticuerpos neutralizantes de Clase 1 que se dirigen a RBD (Figuras complementarias 3a, b)30,31,32.

a Diagramas de cinta que muestran la estructura crioEM del trímero de pico del SARS-CoV-2 en complejo con un TAU-2303 Fab (Fab2303). El protómero RBD "arriba" de la espiga es de color azul. Los otros dos protómeros son de color salmón. La cadena pesada de Fab2303 es de color rosa y la cadena ligera es de color cian. b Izquierda: diagramas de cinta que muestran la estructura cristalina Fab2303-RBD superpuesta a la estructura cristalina ACE2-RBD (PDB: 6M0J). El RBD y el Fab2303 están coloreados como en a. ACE2 es de color verde. Las líneas sólidas y discontinuas en rojo indican los ejes largos de ACE2 y Fab2303, respectivamente. Derecha: el paratopo y el epítopo de Fab2303 mostrados como representaciones de superficie renderizadas. El paratopo de Fab2303 y el epítopo de RBD son de color amarillo. Las líneas rojas indican la huella de ACE2. c Interacciones detalladas entre Fab2303 y SARS-CoV-2 RBD. HCDR y LCDR representan región determinante de complementariedad (CDR) de la cadena pesada y ligera, respectivamente. LFR significa región marco de la cadena ligera. d Comparaciones estructurales de RBD con los mutantes de RBD K417N, K417T, N501Y y E484K. Las estructuras de los mutantes se modelaron en COOT53 utilizando la función de mutación única, en la que solo se cambiaron las cadenas laterales de los residuos mutados. La mayoría de las posibles conformaciones de cadenas laterales de los residuos mutados se generaron y seleccionaron de la biblioteca de rotámeros de COOT y de acuerdo con la energía de unión calculada con PISA. La cadena pesada de Fab2303 es de color rosa y la cadena ligera es de color cian. El RBD y Fab2303 están coloreados como en a, con los residuos de RBD mutados en verde. e Mapeo de superficie de mutaciones clave en diferentes variantes y las posiciones de los sitios mutados en relación con los epítopos de unión reconocidos por TAU-2303. Los epítopos de unión de TAU-2303 están coloreados en amarillo. Los sitios de mutación dentro o fuera del epítopo de unión de TAU-2303 están coloreados en rojo y verde, respectivamente.

Los resultados de ELISA indicaron una reducción en la unión de TAU-2303 a RBD con las mutaciones dobles K417N/N501Y, pero no a K417T/N501Y, o cualquiera de las mutaciones simples K417N, K417T o N501Y (Fig. 1 y Fig. 1 complementaria) . Esto concuerda con los hallazgos de la estructura cristalina de que los residuos K417 y N501 están en contacto directo con TAU-2303. La posición 417 es particularmente crítica para el reconocimiento de TAU-2303, ya que Fab2303-HC-Y52OH forma enlaces de hidrógeno tanto con el átomo N de la cadena principal como con el átomo NH de la cadena lateral de RBD-K417 (Fig. 4c, d y Tabla complementaria 2). El modelado reveló que cuando la lisina en la posición 417 se reemplaza con treonina, tanto los enlaces de hidrógeno de la cadena principal como los de la cadena lateral podrían retenerse (Fig. 4d). Además, es posible establecer un nuevo enlace de hidrógeno entre el átomo OH de la treonina y el átomo OH Fab2303-HC-Y33, disminuyendo así la energía de enlace total calculada con PISA33 de -9,7 kJ/mol a -9,9 kJ/mol. Por el contrario, sustituir la lisina en la posición 417 por asparagina, aumenta la longitud de los enlaces de hidrógeno entre los átomos polares de la cadena lateral ND2H u OD1 con Fab2303-HC-Y33 y Fab2303-HC-Y52, lo que disminuye la favorabilidad de la interacción, como se indica. por el aumento de la energía de enlace calculada de -9,7 kJ/mol a -9,5 kJ/mol (Fig. 4d). La asparagina en la posición 501 tiene un número relativamente grande de contactos con Fab2303. La cadena lateral N501 forma dos enlaces de hidrógeno con los átomos de la cadena principal y la cadena lateral de Fab2303-LC-S30 (Fig. 4c). Si bien estos enlaces de hidrógeno se romperían por completo al reemplazar la asparagina con tirosina, nuestros datos de modelado sugieren que se podrían formar nuevas interacciones de Van der Waals con tirosina en esta posición (Fig. 4d). Dado que estas interacciones propuestas de Van der Waals no podrían compensar completamente los enlaces de hidrógeno perdidos, se predice que el mutante N501Y tendrá una afinidad de unión ligeramente menor a Fab2303, como lo confirman las mediciones de afinidad mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) (Figura complementaria .3c, d). Curiosamente, aunque se demostró que el glutamato en la posición 484 es fundamental para el escape viral de los anticuerpos neutralizantes34,35,36, nuestro análisis estructural indica que E484 no realiza interacciones directas con Fab2303. Este punto se resolvió mediante un examen más detallado de la interfaz RBD y Fab2303, que reveló que E484 interactúa con Fab2303-HC-Y102 a través de una molécula de agua (Fig. 4d). La observación de que las interacciones mediadas por disolventes suelen ser más débiles que los contactos directos es consistente con los resultados de nuestros estudios funcionales de que, a diferencia de los otros mAb ACE2bs, la única mutación E484K no tuvo un impacto significativo en la unión de TAU-2303 (Fig. 1). y figura complementaria 1). Las mutaciones T487K y L452R de RBDDelta están ubicadas fuera del epítopo de unión de Fab2303, lo que explica cómo TAU-2303 aún puede unirse con alta afinidad y neutralizar el COV Delta (Fig. 4e y Fig. Suplementaria 3c, d). Los datos de estructura y modelado explican por qué TAU-2303 puede unirse igualmente bien a una molécula de RBD con una sola mutación, como K417N, E484K y N501Y, pero no a un mutante de RBD con las tres mutaciones, con la mayor pérdida acumulativa de unión. energía. Nuestros datos estructurales que combinan los resultados de bioquímica y neutralización sugieren que la combinación de mutaciones de RBD puede desempeñar un papel clave en conferir resistencia al SARS-CoV-2. Significativamente, la variante Omicron tiene mutaciones en siete residuos dentro del epítopo de unión de Fab2303, incluidos cuatro residuos de contacto clave K417, Q493, Q498 e Y505, lo que proporciona la explicación estructural de la falta de neutralización de Omicron por TAU-2303 (Figs. 3 y 4e).

TAU-2212 es uno de los mAb más potentes de nuestro panel y, si bien no puede unirse a RBD soluble mediante ELISA, inhibe la unión de ACE2 medida por citometría de flujo, lo que sugiere que la unión al receptor se bloquea a través de un mecanismo diferente al empleado por TAU-2303. Para investigar el mecanismo de neutralización de TAU-2212, preparamos Fab2212 escindiendo el mAb TAU-2212 con papaína. El Fab2212 purificado se cristalizó y el cristal se difractó a 2,7 Å. El análisis de datos reveló que el cristal pertenece al grupo espacial P65 con dimensiones de celda a = 75,98 Å, b = 75,98 Å y c = 348,14 Å (Tabla 1), y con dos moléculas en la unidad asimétrica. La estructura se determinó mediante reemplazo molecular y se refinó hasta un R/R libre final de 0,202/0,246. El modelo final de Fab2212 contiene 419 residuos, mientras que los residuos 141–151 y 197–204 de la cadena pesada no son visibles en el mapa (Fig. 5a). No se observaron diferencias significativas entre las dos moléculas en la unidad asimétrica (un RMSD calculado de 0,77 Å entre los átomos de Calpha alineados, figura complementaria 4). Fab2212 no puede formar un complejo estable con el ectodominio de pico del SARS-CoV-2 estabilizado con prefusión (Figura complementaria 5a), pero interactúa con el trímero de pico en la superficie celular9. Con el supuesto de que TAU-2212 se une a una conformación específica del trímero de púas de prefusión que no es estable cuando se recubre en placas ELISA, utilizamos perlas recubiertas con proteína A de TAU-2212 para derribar los trímeros de púas, que luego se sometieron a un análisis estructural crioEM. . La clasificación tridimensional (3D) de CryoEM de las partículas reveló que TAU-2212 se une al trímero de espiga en cinco conformaciones distintas (1–5), con 20339, 15868, 14193, 72056 y 39788 partículas, respectivamente (Figuras complementarias 6 y Tabla 2). En las cinco conformaciones, solo la porción Fab del mAb TAU-2212 es visible, mientras que la región Fc altamente flexible no se ve en los mapas reconstruidos. Las conformaciones 1, 3 y 4 se componen de dos, tres y tres Fabs unidos, respectivamente, con todos los RBD en la posición "abajo". Por el contrario, la conformación 2 tiene un Fab por trímero, con un RBD en la configuración "arriba", mientras que los otros RBD que están unidos por el Fab aparecen en la configuración "abajo". La conformación 5 tiene dos proteínas de pico cabeza a cabeza, que están entrecruzadas por tres mAb (Fig. 5b, c).

Un diagrama de cinta que muestra la estructura cristalina de Fab2212. Las cadenas pesada y ligera son de color rosa y verde claro, respectivamente. Los bucles del CDR son de color amarillo. Los residuos faltantes 141–151 y 197–204 de la cadena pesada se muestran como líneas discontinuas de color rosa. b Diagramas de superficie que muestran las vistas lateral (izquierda) y superior abierta (derecha) del trímero de púas con tres Fabs unidos de mAb TAU-2212. Los RBD del trímero de púas están coloreados en azul y las cadenas pesada y ligera Fab2212 están coloreadas como en a. Los epítopos de unión de las cadenas pesada y ligera alrededor de la unión de dos RBD son de color amarillo y blanco, respectivamente. El residuo E484 está indicado en rojo. c Diagramas de superficie (arriba) y de cinta (abajo) que muestran las cinco conformaciones del complejo de picos TAU-2212. Las cadenas pesada y ligera de los mAb unidos están coloreadas como en a. Los trímeros de púas son de color gris. Los pares de números X, X' indican Fab del mismo mAb. d Interacciones detalladas entre TAU-2212 y el trímero de espiga, ilustradas con la estructura de conformación 1 de alta resolución. Los bucles CDR de cadena pesada y cadena ligera implicados en interacciones directas se muestran en rosa y cian, respectivamente. Los residuos implicados en la formación de enlaces de hidrógeno se muestran en barras con átomos de oxígeno y nitrógeno coloreados de rojo y azul, respectivamente. e Diagramas de cinta y barra que muestran la interrupción de los enlaces de hidrógeno clave en E484 por la mutación E484K. f Diagramas de superficie que muestran el mapeo de mutaciones clave en diferentes variantes y las posiciones de los sitios mutados en relación con los epítopos de unión reconocidos por TAU-2212. Los epítopos de las cadenas pesada y ligera de TAU-2212 son de color amarillo y blanco, respectivamente. Los sitios de mutación dentro o fuera del epítopo de unión de TAU-2212 están coloreados en rojo y verde, respectivamente. g Comparaciones estructurales de los Fabs en las conformaciones 1, 4 y 5. Las alineaciones se realizaron utilizando los RBD (en gris) y las regiones variables de los Fabs unidos. Los Fabs unidos de conformaciones 1, 4 y 5 son de color naranja, negro y azul, respectivamente.

Determinamos las estructuras de las cinco conformaciones con resoluciones de 4.7 Å, 7.3 Å, 6.4 Å, 3.3 Å y 9.4 Å (6.1 Å para el pico único dividido con tres Fabs), respectivamente (Fig. 5b, c, Tabla 2 y Suplementaria). Figuras 6,7). Para la conformación 4, donde la resolución permite la construcción y el refinamiento del modelo ab initio (Figura 8 complementaria), se construyó un modelo atómico de los complejos con la estructura cristalina de Fab2212 y la estructura crioEM del trímero de pico (PDB: 6XEY) como referencias. (Tabla 2). Dado que la resolución de los mapas de las conformaciones 1 a 3 y 5 es demasiado baja para la construcción de modelos ab initio, se construyeron modelos atómicos de los complejos ajustando la estructura cristalina de Fab2212 y la estructura crioEM del trímero S en mapas crioEM.

La conformación 4 del complejo TAU-2212:spike tiene todos los RBD en la posición "abajo" con tres mitades TAU-2212 unidas cerca de las uniones entre los RBD. Cada Fab2212 une y entrecruza dos RBD "hacia abajo" adyacentes (RBD1 y 2) con una superficie enterrada de 823 Å2 en RBD1 y 298 Å2 en RBD2 (Fig. 5b). La comparación de las estructuras de los picos libres y unidos a TAU-2212 reveló que la unión de TAU-2212 induce cambios conformacionales en los RBD, produciendo una rotación en sentido antihorario de 4,1° hacia el eje de simetría, y dando como resultado una estructura de cabeza de RBD más compacta después Unión TAU-2212 (Figura complementaria 9a). Los cambios conformacionales en los RBD acercan los residuos en las interfaces y pueden aumentar las interacciones de Van der Waals entre los RBD. Sin embargo, no se observan contactos adicionales entre los RBD "abajo". Además, los bucles RBD 454–462 y 468–489 que están desordenados en picos libres están bien ordenados en la estructura compleja al formar tres enlaces de hidrógeno con el TAU-2212 unido (Figura complementaria 9b y Tabla complementaria 3). Estos bucles también están ordenados y son visibles tras la vinculación ACE2. Estos datos sugieren que TAU-2212 actúa uniendo y estabilizando el trímero de pico del SARS-CoV-2 en una orientación "hacia abajo" y previene el cambio conformacional hacia "arriba" RBD que se requiere para las interacciones pico:ACE2.

La mayor parte del epítopo reconocido por el mAb TAU-2212 está en uno de los dos RBD (RBD1), y las interacciones se producen predominantemente a través de la cadena pesada, especialmente el bucle CDR3 de la cadena pesada (HCDR3), que está incrustado dentro de la interfaz de dos RBD. Dos bucles CDR de la cadena ligera interactúan directamente con dos residuos en RBD1 (485–486), incluido el enlace de hidrógeno formado entre el átomo de N de F486RBD1 y el grupo OH de Fab2212-HC-Y93 (Fig. 5d). En general, las interacciones entre los bucles HCDR y RBD1 y RBD2 involucran 57 residuos y 13 pares de enlaces de hidrógeno (Fig. 5d y Tabla complementaria 3). Estas interacciones incluyen dos enlaces de hidrógeno formados por el grupo OE2 de E484RBD1, con el grupo OH de Fab2212-HC-Y33 y el grupo ND2 de Fab2212-HC-N52. La longitud del enlace de hidrógeno entre el grupo OE2 de E484RBD1 y el grupo OH de Fab2212-HC-Y33 es de 2,2 Å, lo que sugiere que este enlace de hidrógeno podría ser la interacción principal en la interfaz de contacto. La mutación E484K altera completamente los enlaces de hidrógeno entre el anticuerpo y el RBD (Fig. 5e y Fig. complementaria 5b), lo que proporciona una explicación estructural para la resistencia completa de los VOC Beta y Gamma a TAU-2212. De manera similar, se considera que las mutaciones E484A y Q493R presentes en la variante Omicron probablemente interrumpan los enlaces de hidrógeno clave y, por lo tanto, se espera que afecten la unión de TAU-2212 y reduzcan la capacidad de neutralización (Fig. 5f). La sustitución S373P que está presente en la nueva variante de Omicron también se encuentra dentro de la interfaz TAU-2212. Para probar el efecto de la mutación S373P en la unión de TAU-2212, primero introdujimos una mutación S373G para interrumpir el enlace de hidrógeno mediado por el grupo hidroxilo de la serina 373. Los resultados mostraron que el enlace de hidrógeno mediado por S373 no afectó la unión de TAU-2212. (Figura complementaria 5b). A continuación, realizamos un experimento desplegable para probar la interacción entre el mutante S373P y TAU-2212 (Figura complementaria 5c). Los resultados mostraron que TAU-2212 todavía puede unirse al pico con la mutación S373P, lo que respalda aún más que tanto el enlace de hidrógeno como la fuerza de Van Der Waals mediada por la cadena lateral S373 no desempeñan un papel importante en el pico de unión de TAU-2212. Teniendo en cuenta el efecto de todas las mutaciones juntas, no sorprende que TAU-2212 no neutralice a Omicron.

Dada la flexibilidad y la dinámica de la interacción entre TAU-2212 y el trímero de pico, examinamos la unión de las regiones variables de Fab2212 a los RBD adyacentes en las conformaciones 1 a 5. Notamos que las densidades de Fabs2212 unido eran considerablemente más débiles en la conformación 2 que en las otras conformaciones, lo que indica que la configuración "uno arriba" - "dos abajo" puede no ser favorable para la unión de TAU-2212 (Fig. 5c). Esta posibilidad también fue sugerida por los resultados desplegables. Para obtener el complejo TAU-2212: pico, aplicamos más pico y una gran porción de la proteína de pico estaba en el flujo, lo que probablemente esté en las conformaciones "arriba" de RBD. El análisis estructural de los Fabs unidos indicó que las regiones constantes de los tres Fabs unidos en la conformación 4 (tres Fabs que unen tres RBD "abajo") están ubicadas en un pequeño ángulo de flexión (14,6 °) en relación con las regiones variables que están alineadas con el eje z (Fig. 5g). Además, las tres moléculas están bien separadas (Fig. 5c) y las distancias entre los dos C254 que forman un enlace disulfuro y bucles de reticulación de los Fabs unidos son ~ 21 Å (Fig. 10 complementaria), lo que sugiere que los tres Fabs unidos pertenecen a tres mAb diferentes, en lugar de un mAb que une el trímero con ambos brazos. Los dominios constante y variable de los Fab unidos en la conformación 5 asumen conformaciones similares a las de la conformación 4, lo que sugiere que los Fab unidos en la conformación 5 pertenecen a tres mAb diferentes. A diferencia de la conformación 4, en la conformación 1 sólo están presentes dos Fab por trímero. Las regiones constantes de los dos Fab unidos en la conformación 1 tienen un gran ángulo de flexión (29,6°) y están unidas en el extremo distal. Además, los dos C254 que entrecruzan los bucles de los Fabs unidos tienen una distancia razonable de 4 Å (Figura complementaria 10), lo que sugiere que en este caso, los dos Fabs unidos pertenecen al mismo mAb (Figura 5c y Figura complementaria 10). En particular, la conformación 3 tiene los tres Fab unidos en dos conformaciones distintas. Dos de los Fabs tienen un ángulo de flexión similar al observado en la conformación 1, mientras que uno de los Fabs tiene un ángulo de flexión similar al observado en la conformación 5, lo que indica que la unión de TAU-2212 en la conformación 3 es en modo mixto con dos mAb. . Entre estos, un mAb aporta dos Fab, mientras que un mAb proporciona solo un Fab (Fig. 5c).

El análisis estructural de los picos cabeza a cabeza en la conformación 5 revela tres mAb que entrecruzan dos picos, con los dos Fab de cada mAb en dos posiciones opuestas de 180° alineadas linealmente (Fig. 5c y Fig. complementaria 10c). Como resultado, la región constante del Fab unido en la conformación 5 tiene el ángulo de flexión más pequeño y está casi en un plano con la región variable. Dado que la mayoría de las partículas están en la conformación 4 y no se observaron trímeros de pico con todos los RBD "inferiores" y un TAU-2212 de enlace único, podemos deducir que la unión de un único mAb TAU-2212 al trímero de RBD inferior desencadena un cambio conformacional. que promueve la unión Fab adicional. Con la unión del primer Fab, el segundo Fab del mAb unido será propenso a unirse al epítopo vecino. Sin embargo, la unión de ambos Fabs en un mAb provocará que los Fabs unidos se doblen como se muestra en la conformación 2, lo que reducirá la estabilidad de la interacción. Por lo tanto, el modo de unión en la conformación 1 pronto podría ser reemplazado por el modo de unión en la conformación 4, mientras que la conformación 3 es probablemente un estado intermedio entre las conformaciones 1 y 4. En conjunto, el mAb TAU-2212 adopta un modo de unión único al pico. El mAb TAU-2212 reconoce RBD adyacentes en una conformación "hacia abajo" y entrecruza dos picos uno frente al otro. Sin embargo, un solo Fab2212 apenas se une al trímero de espiga, que es completamente diferente de los mAb S2M1137 y C14438. Al igual que el mAb TAU-2212, las IgG S2M11 y C144 también podrían causar el enlace de picos directos. Nuestro resultado indica que la IgG natural también puede entrecruzar picos y promover la agregación de partículas virales como lo hace el nanocuerpo "biespecífico" Fu239, aunque la conformación de RBD y los epítopos son diferentes en estos complejos.

A pesar del genoma relativamente estable del SARS-CoV-240, la continua propagación de la pandemia mundial ha ido acompañada de la aparición de nuevas variantes con transmisibilidad mejorada y mutaciones que contribuyen a la evasión inmunitaria25,41,42,43,44. Con una mayor afinidad por las células humanas y alteraciones realizadas en los residuos vulnerables dentro del pico, estas nuevas variantes pueden poner en peligro tanto las terapias con mAb como las vacunas. Los COV Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron son de particular interés ya que reemplazaron por completo a la cepa Wuhan-Hu-1 original en “olas” posteriores de la pandemia. La primera parte de nuestro estudio evaluó la inhibición de la unión y la neutralización de nueve anticuerpos, previamente aislados de individuos infectados con SARS-CoV-2 de Wuhan-Hu-19. De acuerdo con otros informes45,46, mostramos que los mAb ACE2bs se ven más afectados por mutaciones virales que los mAb que se unen a regiones fuera de ACE2bs. Si bien estos son generalmente menos potentes contra el virus infectante original, los mAb distintos de ACE2bs parecen tener una actividad más amplia contra variantes emergentes.

En la segunda parte de nuestro estudio, investigamos el mecanismo de neutralización de dos mAb bloqueadores de receptores neutralizantes, TAU-2303 y TAU-2212, a nivel atómico. La estructura atómica de Fab2303:RBD confirmó que TAU-2303 se une a una superficie que también está unida por el receptor ACE2, como observamos mediante ensayos funcionales. A diferencia de otros mAb ACE2bs en nuestro estudio, TAU-2303 permaneció activo contra Delta VOC, probablemente debido a los modos comparables de unión de ACE2 y TAU-2303 con respecto tanto al epítopo como al ángulo de aproximación al RBD. Sin embargo, como la mayoría de los mAb que bloquean la unión al receptor, TAU-2303 fue menos eficaz contra la variante Beta y completamente ineficaz contra la variante Omicron. A continuación, examinamos el mAb atípico, TAU-2212, que exhibe un tipo de unión de flexibilidad de reconocimiento inusual que involucra cinco conformaciones diferentes. TAU-2212 une y entrecruza RBD "hacia abajo" mostrando una flexibilidad conformacional excepcional. Según la estructura ajustada de cada conformación, las interfaces entre el RBD y la región variable del Fab2212 unido son consistentes. Consideramos que la superficie de unión sigue siendo la misma entre las cinco conformaciones. La observación de que TAU-2212 se une al complejo de púas en cinco conformaciones diferentes sugiere una flexibilidad de neutralización que también se logra mediante la estabilización del trímero de púas. La existencia de una gran cantidad de mAb TAU-2212 entrecruzado con picos de cabeza a cabeza sugiere que TAU-2212 puede entrecruzar y agregar partículas virales de manera potente y, por lo tanto, reducir la cantidad de partículas virales efectivas en el pulmón. Además, el modo de unión en las conformaciones 1, 3, 4 o 5 bloquearía cualquier conformación "arriba" de los RBD, bloqueando así la unión al receptor. De esta manera, TAU-2212 exhibe propiedades similares a las de ACE2bs mientras utiliza un mecanismo de acción distinto. Se pueden deducir estrategias alternativas que amplían la capacidad de neutralización a partir de los anticuerpos S2M11 y C144 informados anteriormente que entrecruzan dos RBD "hacia abajo" y tienen un modo de unión similar al de TAU-2212 (Figura complementaria 11). Sin embargo, a diferencia de TAU-2212, tanto S2M11 como C144 pueden unir el trímero de púas solo con el Fab. De los tres anticuerpos, S2M11 tiene la interfaz de unión más grande, mientras que las interfaces de unión de TAU-2212 y C144 son más pequeñas y similares (Figura 11 complementaria). Al igual que TAU-2212, el mAb S2M11 promueve una cabeza RBD compacta, mientras que la unión de C144 promueve el efecto opuesto al forzar la cabeza RBD a adoptar una conformación abierta (Figura complementaria 11b). La interfaz de unión más grande de S2M11 abarca los residuos E484 y L452 y, por lo tanto, se espera que pierda eficacia contra las variantes Beta, Gamma y Delta, mientras que TAU-2212 neutraliza eficazmente a Delta (Fig. 3 y Fig. 11 complementaria). Al igual que otros mAb de su clase, TAU-2212 también mostró una pérdida total de actividad contra los COV Beta, Gamma y Omicron.

En resumen, nuestro estudio proporciona datos estructurales funcionales y a nivel atómico sobre las interacciones entre los anticuerpos provocados naturalmente y las variantes del SARS-CoV-2. Tanto TAU-2303 como TAU-2212 son potentemente neutralizantes, pero surgen a través de diferentes programas de desarrollo de células B. La neutralización por TAU-2212 es exitosa para la mayoría de las mutaciones con la excepción de E484K. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la combinación de mAb que pueden unirse a E484K, como TAU-1109, −2303 o −2310 con TAU-2212, puede ser útil para la neutralización antiviral de amplio espectro.

Utilizamos nuestro plásmido 9 de tipo salvaje informado anteriormente como plantilla para la mutagénesis por PCR diseñada para generar construcciones RBD que albergan mutaciones de un solo aminoácido. Syntezza-Israel diseñó y sintetizó pares de cebadores de ADN superpuestos que contienen una o dos sustituciones de pares de bases flanqueados por 20 bases en cada lado. Las reacciones de PCR se realizaron utilizando ADN polimerasa KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche). Cada reacción de PCR contenía 10 µl de KAPA HiFi HotStart ReadyMix, 0,5 µM de cada cebador y 1 ng de ADN molde, con el volumen de muestra ajustado a 20 µl con agua libre de DNasa/RNasa (Bio-Lab). Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 95 °C durante 3 min, 16 ciclos de 98 °C durante 20 s y 72 °C durante 90 s. Se generaron mutantes de aminoácidos dobles y triples de manera similar con plantillas y cebadores apropiados.

Cada construcción se usó para transfectar transitoriamente células Expi293F (Thermo Fisher) usando el kit de transfección ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher). Siete días después de la transfección, se recogió el sobrenadante celular, se filtró (0,22 µm) y se incubó con perlas de agarosa Ni2+-NTA (GE Life Sciences) durante 2 h a temperatura ambiente (RT). Las proteínas se eluyeron con imidazol 200 mM, se intercambiaron tampón por PBS × 1, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C.

Se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos de alta unión (Corning n.º 9018) con 1 µg/ml de RBD en PBS ×1 durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se descartó el recubrimiento, los pocillos se lavaron con “tampón de lavado” (PBS ×1 y Tween20 al 0,05%) y se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente con 200 µL de “tampón de bloqueo” (PBS ×1, 3% BSA (MP Biomedicals), EDTA 20 mM y Tween20 al 0,05% (Sigma)). Se agregaron anticuerpos a una concentración inicial de 4 µg/ml y siete diluciones adicionales de 4 veces en tampón de bloqueo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado antes de agregar un anticuerpo secundario anti-IgG humana (Jackson ImmmunoResearch) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluido 1:5000 en tampón de bloqueo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de cuatro lavados adicionales, se agregaron 100 µL de TMB (Abcam) a cada pocillo y se leyó la absorbancia a 650 nm después de 20 minutos (BioTek 800 TS).

Las células Expi293F se transfectaron con pcDNA 3.1 que contenía SΔC19 de variantes de tipo salvaje, Alfa, Beta o Delta, utilizando el kit de transfección ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher). Al día siguiente, las células se recogieron, se centrifugaron a 300 x g y se resuspendieron en tampón FACS (PBS x 1, FBS al 2% y EDTA 2 mM). A continuación, las células se dividieron en alícuotas en una placa de 24 pocillos (Corning), de modo que cada pocillo contenía 3 x 106 células en 1 ml de tampón FACS. Se agregaron anticuerpos TAU o mGO53 a los pocillos apropiados a una concentración de 20 µg/ml con hACE2 sin marcar a una concentración de 1 µg/ml. Luego, las células se incubaron durante 30 minutos en una incubadora de CO2 al 8% con agitación suave, se transfirieron a tubos FACS, se lavaron con tampón FACS y se incubaron con hACE2 biotinilada durante 20 minutos a 4 °C. Después de una etapa de lavado adicional, las células se incubaron con 0,5 µg de estreptavidina-APC (Miltenyi Biotec, 130-106-792) y se lavaron nuevamente. La fluorescencia de APC se registró utilizando un CytoFLEX S4 (Beckman Coulter).

Las pseudopartículas de pico de SARS-CoV-2 se obtuvieron cotransfectando células Expi293F con pCMV delta R8.2, pLenti-GFP (Genecopoeia) y pcDNA 3.1 SΔC19 (Thermo Fisher) en una proporción de 1:2:1. respectivamente, según las instrucciones del fabricante. El sobrenadante se recogió 72 h después de la transfección, se centrifugó a 1500 × g durante 10 minutos y se pasó a través de un filtro de 0,45 μm (LIFEGENE, Israel). Luego, el sobrenadante se concentró al 5 % de su volumen original utilizando un Amicon Ultra con un límite de 100 KDa a 16 °C (Merck Millipore). Se sembraron células HEK-293 que expresaban establemente hACE2 en placas de 96 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1% (Greiner) a una densidad inicial de 0,75 x 105 células por pocillo. Al día siguiente, se incubaron pseudopartículas concentradas con diluciones seriadas de anticuerpos durante 1 hora a 37 °C y se agregaron a las placas de 96 pocillos. Después de 48 h, el medio celular se reemplazó con medio DMEM nuevo excluyendo el rojo fenol, y 24 h después, IncuCyte ZOOM (Essen BioScience) tomó imágenes de las placas de 96 pocillos. Se tomaron imágenes de las células con un objetivo de 10 × utilizando la configuración predeterminada del software IncuCyte, que se usó para calcular el número de células positivas para GFP a partir de cuatro imágenes de canales de 488 nm en cada pocillo (los datos para cada anticuerpo se recopilaron por triplicado). El número de células positivas para GFP se normalizó y se convirtió en un porcentaje de neutralización. Se produjeron y probaron de manera similar pseudopartículas que expresan los picos Alfa, Beta y Delta (Tabla complementaria 1).

Todo el trabajo con SARS-CoV-2 se realizó en condiciones de nivel de bioseguridad 3 en la Universidad de California en San Diego. Aislados de SARS-CoV-2 WA1 (USA-WA1/2020, NR-52281), Beta (B.1.351, hCoV-19/Sudáfrica/KRISP-K005325/2020, NR-54009), Gamma (P.1, hCoV -19/Japan/TY7-503/2021, NR-54982) y Delta (B.1.617.2, hCoV-19/USA/PHC658/2021, NR-55611) fueron adquiridos de BEI Resources. Las reservas virales originalmente aisladas en VeroE6 se pasaron una vez a través de células epiteliales bronquiales humanas primarias (NHBEC) diferenciadas en la interfaz aire-líquido (ALI) antes de la expansión en VeroE6-TMPRSS2 (Sekisui XenoTech), denominada aquí Vero-TMPRSS2. La variante Alfa (B.1.1.7) se aisló en NHBEC en ALI a partir de un hisopo nasofaríngeo obtenido bajo UCSD IRB #200477 y se expandió en Vero-TMPRSS2. El aislado se ha depositado en BEI Resources como hCoV-19/USA/CA_UCSD_5574/2020, NR-54020. La variante Omicron (BA.1) se aisló y se expandió en células Vero-TMPRSS2 de un hisopo nasofaríngeo obtenido bajo UCSD IRB #160524 con secuencia depositada en GISAID (EPI_ISL_8186377). Todas las reservas virales se verificaron mediante secuenciación profunda.

Los títulos de virus se validaron utilizando una combinación de ensayo de foco fluorescente y ensayos de dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID)50 en monocapas Vero-TMPRSS2 y Calu-3 (ATCC). Se agregaron diluciones en serie de reservas de virus en DMEM (Corning, #10-014-CV) a monocapas Vero-TMPRSS2 en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con balanceo. Para los ensayos de enfoque fluorescente, las células se cubrieron con carboximetilcelulosa al 1 % en DMEM suplementado con FBS al 2 % y 1x Pen/Strep. Las placas se incubaron a 37 °C en CO2 al 5% durante 24 h según el ensayo y luego se fijaron con una concentración final de formaldehído al 4,5% durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Para los ensayos TCID50, se infectaron células Vero-TMPRSS2 o Calu-3 como se indicó anteriormente y posteriormente se agregaron 100 µl de DMEM o MEM con FBS al 2 % por pocillo. Se observaron las monocapas durante al menos 4 días para detectar la aparición de CPE y luego se fijaron como se indicó anteriormente y se tiñeron con anticuerpo contra la nucleocápside del SARS-CoV-2 (1 µg/ml). La TCID50 se calculó utilizando el método de Reed-Muench47,48,49.

Para la detección de la nucleocápside viral en células Vero-TMPRSS2 mediante inmunofluorescencia, las células se lavaron dos veces con PBS × 1 y se fijaron en formaldehído al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron con PBS ×1 y se permeabilizaron para inmunofluorescencia usando BD Cytofix/Cytoperm según el protocolo del fabricante para células fijadas, y luego se tiñeron para detectar SARS-CoV-2 con un anticuerpo de nucleocápside primario (1 µg/ml) (GeneTex GTX135357). y un anticuerpo secundario anti-conejo AF594 (ThermoFisher, A11037). Los núcleos se contratiñeron con Sytox Green 1 µM. Las células infectadas de exploraciones de pocillos completos se identificaron utilizando el Incucyte S3 (Sartorius). Los datos se registraron desde los módulos de análisis Incucyte y se representaron gráficamente con GraphPad Prism 8.

El RBD del SARS-CoV-2 (residuos Arg319 a Lys529) se expresó mediante el sistema de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen). Se insertó RBD que contenía el péptido señal gp67 y una etiqueta C-terminal 6xHis en pFastBac1 para formar el plásmido pFastBac1-RBD. A continuación, el plásmido se transformó en células que componen DH10 Bac. El bácmido recombinante se extrajo y se transfectó adicionalmente en células Sf9 usando Cellfectin II (Invitrogen, n.° 10362100). Los virus recombinantes se recogieron del sobrenadante transfectado y se amplificaron para generar una reserva de virus de alto título. Luego, los virus se usaron para infectar células Hi5 para la expresión de RBD. El RBD secretado en el sobrenadante se recogió y se aplicó a perlas de agarosa cobalto, luego se eluyó con imidazol 300 mM y se purificó adicionalmente usando una columna Superdex 200 Incremento 10/300 (GE Healthcare) que se ejecuta en un tampón que contiene HEPES 20 mM a pH 8,0 y NaCl 150 mM.

La cadena pesada y la cadena ligera de TAU-2303 o TAU-2212 se clonaron por separado en un vector pCMV y se transfectaron transitoriamente en células HEK293F usando PEI en una proporción de 1:1. El sobrenadante se recogió 4 días después de la transfección. TAU-2212 se capturó y purificó utilizando perlas de proteína A (GE Healthcare), eluyó con glicina 0,1 M a pH 3,2 y luego se neutralizó a pH 7,6.

Para la preparación de Fab, los anticuerpos purificados (TAU-2303 y TAU-2212) se digirieron usando la proteasa papaína (Sigma, #P3125) con una proporción de IgG a papaína de 66:1 (p/p) durante 3 h a 37 °C. C. El dominio Fc y los anticuerpos no digeridos se eliminaron con proteína A Sefarosa (GE Healthcare) y el flujo se recogió y se purificó adicionalmente utilizando una columna Superdex 200 Incremento 10/300 (GE Healthcare) en un tampón que contenía HEPES 20 mM a pH 8,0. y NaCl 150 mM.

El dominio extracelular de la proteína S (S-ECD) (1–1208 aminoácidos, ID del banco de genes: QHD43416.1) se clonó en el vector pCMV con seis sustituciones de prolina en los residuos 817, 892, 899, 942, 986 y 987 ( S6P mutante) o dos sustituciones de prolina en los residuos 967 y 968 (mutante S2P)50, una sustitución "GSAS" en los residuos 682 a 685 y un motivo de trimerización de fibritina T4 C-terminal seguido de una etiqueta StrepII (mutante S6P) o un Flag etiqueta (mutante S2P). Los plásmidos pCMV S2P o S6P se usaron para transfectar transitoriamente células HEK293F con polietilenimina (PEI) (Polysciences, n.º 24765). La S6P recombinante se purificó por afinidad a partir del sobrenadante celular utilizando resina StrepTactin (IBA). El material eluido se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna Superose 6 10/300 (GE Healthcare) que funcionaba en HEPES 20 mM, pH 8,0 y NaCl 150 mM. El sobrenadante que contenía S2P se recogió 4 días después de la transfección, el S2P se purificó por afinidad mediante perlas de anticuerpo anti-Flag y se eluyó utilizando 0,1 mg/ml de péptido Flag 3x en HEPES 20 mM a pH 7,6 y NaCl 150 mM.

La porción Fab de TAU-2303 se mezcló con RBD en una proporción molar de 1:2 a 4 °C, y el complejo resultante se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño con una columna Superdex 200 Incremento 10/300 funcionando en NaCl 150 mM y Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Las fracciones del pico que contenían el complejo se recogieron y se concentraron a 6,5 ​​mg/ml para su cristalización. Los cristales de RBD-Fab2303 se cultivaron a 18 °C utilizando el método de difusión de vapor de gota colgante con 1 μl de proteína mezclada con 1 μl de solución de depósito que contenía tartrato de sodio dihidrato dibásico 0,2 M y polietilenglicol 3350 al 14 % (p/v). Los cristales se empaparon en la solución del depósito suplementada con 15% de glicerol y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para la recopilación de datos.

La porción Fab de TAU-2212 se concentró a 7 mg/ml para su cristalización. El cristal se hizo crecer a 16 °C en polietilenglicol 3350 al 26 % (p/v), (NH4)2SO4 0,2 M, pH 8,0. Los cristales se empaparon en la solución del depósito suplementada con glicerol al 10% y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para la recopilación de datos.

Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en las líneas de luz BL18U (RBD-Fab2303) y BL02U (Fab2212) del Centro de Investigación de Sincrotrones de Shanghai. La longitud de onda fue de 0,980 Å y la temperatura de recolección de datos fue de 100 K. Los datos se procesaron y escalaron con HKL200051. La estructura se determinó mediante reemplazo molecular utilizando PHASER52. La construcción manual y los ajustes de las estructuras se realizaron en COOT53. La estructura de RBD-Fab2303 se refinó utilizando PHENIX54. El procesamiento de datos mostró que el cristal de Fab2212 pertenece al grupo espacial P65. Sin embargo, la macla merohédrica parece asignar el cristal al grupo espacial P6522. La estructura de Fab2212 se refinó con los datos hermanados utilizando Refmac555 con el operador de hermanamiento k, h, -l y una relación de hermanamiento inicial estimada de 0,52 a 0,48 entre los dos dominios. La proporción de gemelo refinada final entre los dos dominios fue de 0,60 a 0,40. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se enumeran en la Tabla 1. Las estadísticas de Ramachandran son las siguientes: 97,24 % favoreció y 2,76 % permitió RBD-Fab2303; 95,26% favoreció, 4,5% permitió y 0,24% valor atípico para Fab2212. En el refinamiento de Fab2212, los valores en las columnas de desviaciones Rwork/Rfree y Rms se obtuvieron de la salida del trabajo refmac5. El análisis estructural de los contactos anticuerpo-antígeno se evaluó a través de CCP4i56 (Tablas complementarias 2,3). Todas las representaciones estructurales se prepararon mediante el uso de UCSF Chimera y ChimeraX57,58.

Se mezcló Fab2303 con el trímero S6P purificado (relación molar de Fab por protómero de 2:1) para formar el complejo Fab-S a una concentración de 2 mg/ml. La mezcla se incubó en hielo durante 30 min. A continuación, se aplicaron 3 μl de la mezcla a rejillas de carbono perforadas de descarga luminosa (Quantifoil, malla Cu 200, R1.2/1.3). La rejilla se secó durante 4,5 s con 100 % de humedad antes de congelarse instantáneamente en etano líquido utilizando un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher). Para la preparación del complejo TAU-2212-S2P, se incubaron S2P y TAU-2212 durante 30 minutos en hielo en una proporción molar de 1:2. El complejo anticuerpo-pico se purificó mediante perlas de proteína A. La elución neutralizada se purificó adicionalmente mediante perlas de anticuerpo anti-bandera. El complejo eluido se entrecruzó con glutaraldehído al 0,125% durante 20 min. La muestra reticulada se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño con una columna Superose 6 10/300. La fracción objetivo se recogió y se concentró a 0,8 mg/ml para la preparación de la rejilla crioEM utilizando condiciones similares a las utilizadas para S6P y Fab2303.

Los datos de imagen de los complejos S6P-Fab2303 y S2P-mAb-TAU2212 se recolectaron en un microscopio electrónico Titan Krios (FEI Company) equipado con una pistola de emisión de campo operada a 300 kV y una cámara Gatan K3 Summit. Las imágenes de S6P-Fab2303 se registraron en un rango de desenfoque de −1,5 a −2,8 μm, con un tamaño de píxel de 1,25 Å. Se utilizó una dosis total de ~ 50 electrones por Å2. Se utilizó SerialEM para la recopilación de datos. Se recopilaron un total de 2599 pilas de películas para S6P-Fab 2303 y 4675 pilas de películas para S2P-TAU2212. Los fotogramas de cada pila de películas se alinearon, sumaron y agruparon 2 veces utilizando Motion Cor259. Los parámetros CTF de las micrografías fueron determinados por Gctf teniendo en cuenta las variaciones de desenfoque locales60. Para el complejo S6P-Fab2303, se empaquetaron un total de 546293 partículas usando Gautotch y luego se sometieron a clasificación 2D usando RELION61. La estructura crioEM del pico de SARS-CoV-2 en estado cerrado (número de acceso de PDB: 6VXX62) se filtró de paso bajo a 40 Å y se utilizó como modelo inicial. Se seleccionaron un total de 38331 partículas para el refinamiento 3D final sin imponer ninguna simetría, lo que produjo un mapa crioEM con una resolución de 4,5 Å (Tabla 2).

Para el complejo S2P-mAb-TAU2212, los datos se recopilaron con un desenfoque de -1,5 a -2,0 µm, con un tamaño de píxel de 0,97 Å. Gautotch recogió 90569 partículas y luego las sometió a clasificaciones 2D con RELION 3.0. Los resultados de la clasificación 2D mostraron dos clases principales, una con un solo pico y la otra con dos picos entrecruzados uno con otro. Las partículas de las dos clases se dividieron para clasificaciones 3D separadas en RELION 3.0. Para los picos reticulados cabeza a cabeza, se seleccionaron 39788 partículas para el refinamiento 3D con simetría D3 impuesta, lo que resultó en un mapa crioEM con una resolución de 9,36 Å. Para mejorar la reconstrucción, las partículas de púas cabeza a cabeza se dividieron en dos partículas, cada una con una púa y tres Fabs unidos. Las partículas divididas se sometieron a refinamientos locales, lo que dio como resultado un mapa crioEM con una resolución de 7,3 Å. La resolución del mapa con una máscara ajustada generada por cryoSPARC se mejoró a 6,1 Å (Figura complementaria 6).

Gautotch seleccionó las partículas en clases con un solo pico y las sometió a una clasificación 2D. Las partículas seleccionadas se sometieron a una clasificación 3D con un mapa crioEM de trímero S como referencia (número de acceso de PDB: 6XEY63). Esto produjo cuatro conformaciones distintas: la conformación 1 tiene dos Fab unidos; la conformación 2 tiene sólo un Fab ligado; la conformación 3 tiene dos Fab de un mAb y un Fab del otro mAb; y la conformación 4 es triplemente simétrica y tiene tres Fabs unidos. Se seleccionaron partículas de cada conformación y se usaron para el refinamiento contra un pico "todo hacia abajo" de RBD que pasó a 60 Å. Para la conformación 4, los refinamientos finales se realizaron con 72056 partículas seleccionadas y se impuso simetría C3. La resolución del mapa final reconstruido es de 3,5 Å. Aplicamos los medios mapas refinados de Relion a cryoSPARC para la estimación de la resolución local y con la máscara de ajuste automático generada por cryoSPARC y la herramienta de filtro local, la resolución del mapa posprocesado se mejoró a 3,3 Å. Las densidades de las cadenas laterales son claramente visibles en la mayor parte del mapa reconstruido (Figura complementaria 8). Para las conformaciones 1, 2 y 3, los refinamientos finales se realizaron con 20339, 15868 y 14193 partículas seleccionadas, respectivamente, y sin imponer ninguna simetría. Los refinamientos dieron como resultado un mapa crioEM con una resolución de 5,5 Å para la conformación 1, un mapa crioEM con una resolución de 7,8 Å para la conformación 2 y un mapa crioEM con una resolución de 6,5 Å para la conformación 3. El procesamiento del mapa crioEM para la conformación 1 fue equivalente a la conformación 4 de cryoSPARC, y la resolución se mejoró a 4,7 Å. Para mantener las características de Fab en la conformación 2 y 3, utilizamos máscaras más flexibles en los trabajos de filtro local crioSPARC y la resolución final fue de 7,3 Å y 6,4 Å, respectivamente.

Todos los mapas de densidad refinados se aplicaron con un factor B negativo y se corrigieron según la función de transferencia de modulación (MTF) del detector. La resolución informada se basa en el criterio de correlación de conchas de Fourier (FSC) estándar de oro de 0,14364,65 (Figura complementaria 7).

Todos los gráficos se generaron y la SD se calculó utilizando Prism versiones 8 y 9.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas y los mapas EM se han depositado en el Protein Data Bank (http://www.pdb.org) y el EM Data Bank, respectivamente: complejo Fab2303-RBD (PDB: 7WBZ), complejo Fab2303-S (EMD: 32411), Fab2212 (PDB: 7WC0), complejo mAb2212-S en conformación 1 (EMD: 32416), conformación 2 (EMD: 32417), conformación 3 (EMD: 32418), conformación 4 (EMD: 32421, PDB: 7WCD) , conformación 5 con púas cabeza a cabeza (EMD: 32420) y conformación 5 con púa única (EMD: 32419).

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Agradecemos a los miembros de los laboratorios Xiang y Freund por sus fructíferos debates y asistencia. Agradecemos a Noam Ben-Shalom y al Centro Blavatnik para el Descubrimiento de Fármacos de la Universidad de Tel Aviv por su ayuda con las mediciones de SPR. NTF está financiado por la subvención número 1422/18 de la ISF. MGT y NTF están financiados por la subvención número 3711/20 de KillCorona ISF. YX está financiado por el Spring Breeze Fund de la Universidad de Tsinghua, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones: 31925023, 21827810, 31861143027), el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (subvención 2021YFA1300200), el Centro de Investigación Fronteriza de Estructura Biológica de Beijing y el Centro de Innovación Avanzada para Biología Estructural de Beijing. La AFC cuenta con el apoyo de una subvención de los NIH (K08 AI130381) y la AFC cuenta con el apoyo del Career Award for Medical Scientists del Burroughs Wellcome Fund. MD está financiado por la subvención BARD n.º IS-5270-20R y la subvención ISF n.º 401/18. BAC cuenta con el apoyo de una subvención de la Fundación Binacional de Ciencias de Estados Unidos e Israel. El siguiente reactivo fue depositado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades y obtenido a través de BEI Resources, NIAID, NIH: SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020, NR-52281. El siguiente reactivo se obtuvo a través de BEI Resources, NIAID, NIH: SARS-Related Coronavirus 2, Isolate hCoV-19/South Africa/KRISP-K005325/2020, NR-54009, aportado por Alex Sigal y Tulio de Oliveira. El siguiente reactivo se obtuvo a través de BEI Resources, NIAID, NIH: SARS-Related Coronavirus 2, Isolate hCoV-19/Japan/TY7-503/2021 (Brasil P.1), NR-54982, aportado por el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. El siguiente reactivo se obtuvo a través de BEI Resources, NIAID, NIH: SARS-Related Coronavirus 2, Isolate hCoV-19/USA/PHC658/2021 (Lineage B.1.617.2; Delta Variant), NR-55611, aportado por el Dr. Richard. Webby y la Dra. Anami Patel. Agradecemos a la Dra. Louise Laurent por proporcionar la muestra clínica B.1.1.7 para el aislamiento viral y al Laboratorio de Microbiología del Centro de Medicina de Laboratorio Avanzada de UC San Diego por proporcionar la muestra clínica BA.1. Agradecemos a UC San Diego EXCITE por la secuenciación del genoma del SARS-CoV-2.

Estos autores contribuyeron igualmente: Ruofan Li, Michael Mor, Bingting Ma.

Centro de Innovación Avanzada de Biología Estructural de Beijing, Centro de Investigación Fronteriza de Estructura Biológica de Beijing, Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina, Universidad de Tsinghua, Beijing, China

Ruofan Li, Bingting Ma y Ye Xiang

Departamento de Microbiología e Inmunología Clínica, Facultad de Medicina, Universidad de Tel Aviv, Tel Aviv, Israel

Michael Mor y Natalia T. Novio

Departamento de Medicina, Universidad de California San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Alex E. Clark y Aaron F. Carlin

Laboratorio de Biología Estructural de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina Azrieli, Universidad Bar Ilan, Tsafed, Israel

Joel Alter y Moshe Dessau

Laboratorio de Virología Molecular, Facultad de Medicina Azrieli, Universidad Bar Ilan, Tsafed, Israel

Michal Werbner y Meital Gal-Tanamy

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina, UC San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Jamie Casey Lee, Sandra L. Leibel y Ben A. Croker

Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, California, EE. UU.

Sandra L. Leibel

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MM planificó y realizó los experimentos bioquímicos, analizó datos, preparó las figuras y escribió el manuscrito junto con NTF, YX y BACRL, y BM realizó la determinación y análisis de la estructura cristalina y crioEM, preparó las figuras y escribió el manuscrito junto con NTF. YX y BACMW, JA, MD y MGT realizaron los ensayos pseudovirales. JCL realizó el mantenimiento de líneas celulares y la configuración de placas para ensayos BSL-3. AEC y AFC realizaron la generación y titulación de virus. SLL y BAC diseñaron y realizaron ensayos BSL-3. YX, NTF y BAC planificaron y supervisaron los experimentos, analizaron los datos y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Ben A. Croker, Ye Xiang o Natalia T. Freund.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Todos los autores cumplen con los criterios de autoría y dieron su consentimiento para figurar como autores de este manuscrito.

Communications Biology agradece a Elisa Fadda, Alex Cohen y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Isabelle Lucet y Gene Chong. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Li, R., Mor, M., Ma, B. et al. Flexibilidad conformacional en la neutralización del SARS-CoV-2 mediante anticuerpos anti-SARS-CoV-2 provocados naturalmente. Común Biol 5, 789 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03739-5

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Recibido: 17 de febrero de 2022

Aceptado: 18 de julio de 2022

Publicado: 05 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03739-5

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