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Jun 21, 2023

La transición de fase y el montaje del complejo de remodelación son importantes para SS18

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 2724 (2022) Cita este artículo 2758 Accesos 4 Citas 1 Detalles de métricas Altmetric La oncoproteína SS18-SSX es un sello distintivo de los sarcomas sinoviales. Sin embargo,

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 2724 (2022) Citar este artículo

2758 Accesos

4 citas

1 altmétrica

Detalles de métricas

La oncoproteína SS18-SSX es un sello distintivo de los sarcomas sinoviales. Sin embargo, como parte de la proteína de fusión SS18-SSX, la función de SS18 aún no está clara. Aquí, representamos las estructuras de los subcomplejos SS18/BRG1 humano y SNF11/SNF2 de levadura. Ambos subcomplejos se ensamblan en heterodímeros que comparten una conformación similar, lo que sugiere que SNF11 podría ser un homólogo de SS18 en los complejos de remodelación de la cromatina. Es importante destacar que nuestro estudio muestra que la autoasociación de la región intrínsecamente desordenada, el dominio QPGY, conduce a la separación de fases líquido-líquido (LLPS) de SS18 o SS18-SSX y al posterior reclutamiento de BRG1 en condensados ​​separados por fases. Además, nuestros resultados muestran que los residuos de tirosina en el dominio QPGY juegan un papel decisivo en el LLPS de SS18 o SS18-SSX. Las perturbaciones de la unión de SS18-SSX LLPS o de SS18-SSX a BRG1 alteran la transformación de las células NIH3T3 mediante SS18-SSX. Nuestros datos demuestran que tanto el LLPS como el ensamblaje en remodeladores de cromatina contribuyen a la actividad oncogénica de SS18-SSX en los sarcomas sinoviales.

El sarcoma sinovial (SyS) es una neoplasia maligna que representa entre el 10 y el 20% de todos los tumores de tejidos blandos con mal pronóstico en adultos jóvenes1. La característica genética distintiva de SyS es la translocación cromosómica recurrente y específica, t(X;18)(p11.2;q11.2), en la que el gen SS18 en el cromosoma 18 se fusiona con uno de los tres genes estrechamente relacionados en el cromosoma 18. Cromosoma X, SSX1, SSX2 y, raramente, SSX42,3,4, lo que da como resultado un gen de fusión en marco SS18-SSX. Esta notable translocación está presente en prácticamente el 100% de los sarcomas sinoviales y, a menudo, es la única aberración citogenética1. A diferencia de las translocaciones convencionales en otros sarcomas de tejidos blandos, la proteína de oncofusión SS18-SSX carece de un dominio de unión al ADN y se cree que ejerce su actividad combinándose con otros modificadores de la cromatina5.

El complejo de remodelación de cromatina dependiente de ATP BAF, también conocido como complejo SWI/SNF de mamíferos, es un remodelador de múltiples subunidades y es crucial para regular la expresión genética y la programación del desarrollo. La mala regulación del complejo BAF conduce a trastornos neurológicos y neoplasias malignas en humanos6. Además, SS18, como parte de la quimera SS18-SSX, es una subunidad integral del complejo canónico BAF (CBAF) al unirse al complejo CBAF mediante la interacción con la subunidad catalítica BRG1 o BRM7,8,9,10. La arquitectura recientemente obtenida del complejo CBAF humano ha proporcionado cierta información estructural sobre el ensamblaje del complejo y la remodelación de la cromatina; sin embargo, la información estructural sobre SS18 en el complejo CBAF ensamblado es limitada11,12. En particular, es específico de SyS que la competencia entre SS18 y SS18-SSX por el ensamblaje dentro del complejo CBAF conduce a un complejo bioquímicamente aberrante y, por lo tanto, altera la expresión génica13,14.

Se ha informado que la eliminación de los 181 aminoácidos N-terminales de la oncoproteína SS18-SSX1 provoca la pérdida de su actividad transformadora15. Esta observación, junto con los resultados que muestran que la sobreexpresión de SS18 o SSX por sí sola no genera tumores, implica que ambos socios de SS18-SSX desempeñan papeles importantes en la sarcomagénesis sinovial13,15. Además, SS18 o SS18-SSX presenta un dominio de secuencia de baja complejidad (LCD), que es rico en glutamina, prolina, glicina y tirosina (el dominio QPGY) y es importante para la actividad transcripcional15,16. En particular, se informó que las LCD intrínsecamente desordenadas de la familia de proteínas FUS/EWS/TAF15 (FET) de oncofusión implican la formación de condensados ​​de proteínas dinámicos a través de un proceso físico conocido como separación de fases líquido-líquido (LLPS) que controla la transcripción genética17,18,19 . En conjunto, es de gran importancia para probar el papel de SS18 en la oncofusión SS18-SSX1 a través de su unión al complejo CBAF o al dominio QPGY en la aparición y desarrollo de SyS. En este estudio, informamos las estructuras cristalinas del heterodímero humano SS18/BRG1 derivado del complejo CBAF de mamíferos y el heterodímero de levadura SNF11/SNF2 derivado del complejo SWI/SNF de S. cerevisiae, con una resolución de 2,39 y 2,15 Å, respectivamente. Además, nuestros resultados revelan que la LCD de SS18 o SS18-SSX (dominio QPGY) puede conducir a LLPS a través de la autoasociación mediada por residuos de tirosina. Nuestro estudio sugiere que la separación de fases de SS18-SSX y la unión de SS18-SSX al complejo de remodelación de la cromatina son importantes para la actividad de transformación de la oncoproteína SS18-SSX.

La proteína de oncofusión SS18-SSX1 se genera sustituyendo los ocho residuos carboxilo terminales extremos de SS18 (aa 379–387) con un fragmento de 78 residuos carboxilo terminal de SSX1 (aa 111–188) (Fig. 1a). Se informó que SS18 o SS18-SSX1 pueden unirse a la región N-terminal de la subunidad BRG1 de ATPasa o BRM del complejo de remodelación de cromatina9,10. Sin embargo, la información estructural de la unión de SS18 al complejo de remodelación sigue siendo limitada en las estructuras reportadas11,12. En consecuencia, inicialmente confirmamos la interacción entre un fragmento N-terminal de 282 residuos de BRG1 (aa 1–282, Brg1(1-282)) y SS18, aquí denominado BRG1(1-282)/SS18, (“/” denota complejos de proteínas con cadenas separadas y estructuras similares a partir de ahora) al mostrar que las dos proteínas coeluyeron de una columna de exclusión de tamaño (Figura complementaria 1a). A continuación, mapeamos cada región de unión de BRG1 y SS18 utilizando un método basado en truncamiento combinado con cromatografía de exclusión por tamaño (Figuras complementarias 1b-d). En particular, BRG1 (172-213) y SS18 (14-101) se ensamblaron en un complejo en una columna analítica de exclusión de tamaño (línea negra en la figura complementaria 1c y SDS-PAGE en la figura complementaria 1d). La ultracentrifugación analítica confirmó además que el complejo BRG1 (172-213) / SS18 (14-101) forma un heterodímero con una estequiometría de 1: 1 y una masa molecular de 14, 7 kDa (línea negra en la figura complementaria 1f). Dados estos resultados, concluimos que el subcomplejo BRG1/SS18 o BRG1/SS18-SSX1 forma un heterodímero mediante la interacción entre los fragmentos BRG1(172-213) y SS18(14-101).

a Representación esquemática de SS18, SSX1, SS18-SSX1 y BRG1 completos. La oncoproteína SS18-SSX1 abarca 457 aminoácidos y conserva los 379 aminoácidos amino-terminales de SS18, así como los 78 aminoácidos carboxi-terminales de SSX1. Los fragmentos de proteína del complejo SS18(14–101)/BRG1(172–213) utilizados para la determinación estructural se indican con una flecha de dos direcciones y son de color cian y magenta, respectivamente. El diagrama esquemático del inserto indica el mutante SS18(3M)-SSX1, que contenía tres aminoácidos I32, L54 y A65 mutados a ácido glutámico en el dominio SNH, y el mutante SS18(Y19S)-SSX1, que contenía 19 tirosinas. residuos mutados a serina en el dominio QPGY. b Representación en caricatura del complejo SS18(14-101) (cian)/BRG1(172-213) (magenta) visto desde un lado y desde abajo. Los extremos N y C de las dos proteínas están marcados. Código de entrada PDB: 7VRB. Los diagramas de Ligplot c – e en el marco negro indican interacciones hidrofóbicas entre SS18 y BRG1. Tres grupos de núcleos hidrofóbicos se muestran como arcos de radios, respectivamente en (c – e). f Experimentos Co-IP que prueban la interacción entre SS18 de tipo salvaje (WT) o el mutante SS18 (3M) y BRG1. El mutante SS18(3M) contiene tres mutaciones de aminoácidos I32E, L54E y A65E. Se prepararon extractos a partir de células HEK293T transfectadas con combinaciones de plásmidos, como se indica. El panel inferior muestra el 3% del Myc-Brg1 como entrada para cada IP.

Para comprender cómo se unen BRG1 y SS18, o SS18-SSX1, intentamos determinar la estructura cristalina del heterodímero BRG1(172-213)/SS18(14-101). Logramos obtener cristales del polipéptido único creado por la fusión de BRG1 (172-213) con el extremo N de SS18 (14-101) con un segmento escindible del virus del grabado del tabaco (TEV). La proteína de fusión monocatenaria purificada de BRG1(172-213) y SS18(14-101), denominada en el presente documento BRG1(172-213)-SS18(14-101), ("-" denota proteínas en una fusión monocatenaria , estructuras similares a partir de ahora) se eluyó como un pico único de una columna analítica de exclusión por tamaño (línea roja en la figura complementaria 1c y SDS-PAGE en la figura complementaria 1e) y se ensambló en un heterodímero con una masa molecular de 15,8 kDa del Experimento de velocidad de sedimentación (SV) (línea roja en la figura complementaria 1f). La estructura cristalina de BRG1 (172-213) -SS18 (14-101) se determinó a una resolución de 2,39 Å con cuatro copias de la molécula compleja en una unidad asimétrica (Tabla complementaria 1). En el modelo final, BRG1 (172-213) se resolvió de aa 172 a 207, incluido el dominio QLQ (Fig. 1b y Fig. complementaria 2). SS18 (14-101) se resolvió bien desde aa 14 a 79, incluido el dominio SNH (Fig. 1b y Fig. complementaria 3). La estructura general de BRG1(172-213)-SS18(14-101) se asemeja a un haz de cuatro hélices, que abarca los residuos 174–190 (αA), 198–205 (αB) en BRG1(172-213) y los residuos 19. –39 (α1), 44–74 (α2) en SS18 (14-101) (Fig. 1b y Figs. complementarias 2 y 3). La interacción entre BRG1 (172-213) y SS18 (14-101) se mantuvo mediante enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Los aminoácidos hidrofóbicos (I32, L54 y A65) en SS18 y los aminoácidos en las posiciones correspondientes de BRG1 forman tres grupos de núcleos hidrofóbicos (Fig. 1c-e).

Para validar las interacciones observadas en la estructura del complejo BRG1 (172-213) –SS18 (14-101), realizamos una serie de estudios de mutagénesis. Los residuos A65, L54 e I32 se mutaron a ácido glutámico en SS18 o SS18-SSX1, aquí denominados SS18 (3M) y SS18 (3M) -SSX1, respectivamente (Fig. 1c-e). Como se anticipó, los análisis de co-inmunoprecipitación (co-IP) mostraron que las mutaciones 3M en SS18 o SS18-SSX1 pueden alterar en gran medida la unión de SS18 (carril 3 en comparación con el carril 2 en la Fig. 1f) o SS18-SSX1 (carril 4 en comparación con al carril 2 en la figura complementaria 4a) a BRG1. Utilizamos dicroísmo circular para confirmar un comportamiento similar entre el SS18(14-101) de tipo salvaje (WT) y el mutante, lo que aseguró que cualquier pérdida en la actividad de unión de BRG1 no se debiera a una disminución de la estabilidad de la proteína SS18(14-101) (Figura complementaria. 1g). Además, de acuerdo con las interacciones de los enlaces de hidrógeno entre BRG1 (172-213) y SS18 (14-101), los residuos Q176 y Q183 de BRG1 se sustituyeron con alanina (Figura complementaria 1h). Sorprendentemente, las mutaciones dobles (Q176A, Q183A) o simples (Q183A) abolieron casi por completo la unión de BRG1 a SS18 (Figura complementaria 1i). En conjunto, estos resultados confirmaron el modo de interacción revelado por la estructura de BRG1(172-213)-SS18(14-101).

Estudios previos han informado estructuras del complejo SWI/SNF de levadura20,21. Sin embargo, existe información estructural limitada sobre SNF11, ya que es una parte indispensable del complejo22. De acuerdo con la alineación de la secuencia, encontramos que la levadura SNF11 estaba altamente conservada en el dominio SNH del SS18 humano, que participa en la unión al dominio QLQ de BRG1 (Fig. 1 y Fig. 3 complementaria). Esta observación, junto con la alineación de secuencia que muestra que los dominios QLQ de BRG1 y SNF2, el homólogo de levadura de BRG1, están altamente conservados, sugiere que SNF11 podría ensamblarse en el complejo SWI/SNF mediante la unión al dominio QLQ de SNF2 (Figura complementaria. 2). Por lo tanto, coexpresamos SNF11 y un fragmento de 60 residuos, incluido el dominio QLQ de SNF2 (aa 248–308, SNF2(248-308)), y confirmamos que SNF11 y SNF2(248-308) se ensamblaron en un complejo heteromérico como se indica. por su coelución de una columna analítica de exclusión de tamaño (Figura complementaria 5a). A continuación, asignamos la región de unión a SNF2 en SNF11 a un fragmento de 132 residuos (aa 38-169, SNF11 (38-169); Fig. 2a y Fig. Suplementaria 5b). La ultracentrifugación analítica confirmó además que el complejo SNF11 (38-169) / SNF2 (248-308) formó un heterodímero con una estequiometría de 1: 1 y una masa molecular de 20,0 kDa (Figura complementaria 5c). Dados estos resultados, llegamos a la conclusión de que la subunidad SNF11 se ensambla en el complejo SWI/SNF formando un heterodímero mediante la interacción entre los fragmentos SNF11 (38-169) y SNF2 (248-308).

a Representación esquemática de SNF11 y SNF2 completos. Los fragmentos de proteína del complejo SNF11(38-169)/SNF2(248-308) utilizados para la determinación estructural se indican con una flecha de dos direcciones y son de color naranja y verde, respectivamente. b Representación en caricatura del complejo SNF11(38-169) (naranja)/SNF2(248-308) (verde) visto desde un lado y desde abajo. Los extremos N y C de las dos proteínas están marcados. Código de entrada PDB: 7VRC. c El diagrama de Ligplot en el marco negro indica las interacciones de enlaces de hidrógeno entre SNF11 y SNF2. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas de puntos negras. Los números encima de las líneas representan la distancia y la unidad es Å. Los puntos sólidos negros representan átomos de carbono, los puntos sólidos azules representan átomos de nitrógeno y los puntos sólidos rojos representan átomos de oxígeno. d Experimentos Co-IP que prueban la interacción entre SNF2 de tipo salvaje (WT) o el mutante SNF2 y SNF11. Se prepararon extractos a partir de células HEK293T transfectadas con combinaciones de plásmidos, como se indica. El panel inferior muestra el 3% del Myc-SNF2 como entrada para cada IP.

Para revelar el modelo de unión de SNF11 y SNF2, determinamos la estructura cristalina del complejo SNF11(38-169)/SNF2(248-308) a una resolución de 2,15 Å, con dos copias de la molécula compleja en una unidad asimétrica ( Tabla complementaria 1). En el modelo final, todos los residuos eran visibles, excepto los residuos 38 a 54 de SNF11 (38-169) y los residuos 298 a 308 de SNF2 (248-308). La superposición de las estructuras de los heterodímeros SNF11(38-169)/SNF2(248-308) de levadura y BRG1(172-213)-SS18(14-101) humano indicó que los subcomplejos SS18/BRG1 humano y SNF11/SNF2 de levadura comparten heterodímeros similares. modelo de montaje (Figura complementaria 5d). La estructura general de SNF11(38-169)/SNF2(248–308) se asemeja a un haz de seis hélices, en el que SNF2(248-308) se compone de tres hélices α [residuos 251–267 (αA'), 274 –285 (αB') y 289–296 (αC')] y SNF11(38-169) también se compone de tres hélices α [residuos 61–94 (α1'), 99–130 (α2') y 155-168 (α3')] (Fig. 2b y Figs. complementarias 2 y 3). La unión de SNF11 a SNF2 estuvo mediada principalmente a través de enlaces de hidrógeno entre varios pares de aminoácidos, incluida la unión de Q63SNF11 a Q252SNF2 y la unión de L70SNF11, N73SNF11 o S74SNF11 a Q259SNF2, individualmente (Fig. 2c). Además, los residuos de SNF2 Q252 y Q259 se conservan desde la levadura hasta el ser humano (Figura complementaria 2). Para validar las interacciones entre SNF2 y SNF11 en la estructura del heterodímero, los residuos Q252 y Q259 se reemplazaron con alanina. Como se anticipó, el análisis co-IP indicó que la mutación única Q259A debilita dramáticamente la unión de SNF2 a SNF11 (carril 3 en comparación con el carril 2 en la Fig. 2d), y que las mutaciones dobles Q252A y Q259A eliminan por completo la interacción entre SNF2 y SNF11 ( carril 4 en comparación con el carril 2 en la Fig. 2d). En conjunto, estos resultados confirmaron el modo de interacción entre SNF2 y SNF11 revelado por la estructura del heterodímero SNF11(38-169)/SNF2(248-308).

Como se mencionó anteriormente, nuestros estudios estructurales y bioquímicos mostraron que las uniones de SS18 humano o SS18-SSX1 de oncofusión a BRG1 y SNF11 de levadura a SNF2 comparten un modo de ensamblaje similar. En comparación con SNF11, SS18 contiene una región carboxilo adicional, incluido el dominio QPGY (Figs. 1a y 2a y Fig. complementaria 3). Curiosamente, un análisis IUPred indicó que la región carboxilo de SS18 también está intrínsecamente desordenada23 (Fig. 3a). A partir de estos datos, junto con las observaciones que muestran que el dominio QPGY es rico en residuos de tirosina, que participan en interacciones multivalentes para impulsar la proteína LLPS, inferimos que SS18 podría formar condensados ​​in vitro e in vivo18,24. Como se esperaba, la proteína SS18 purificada marcada con fluorescencia (Alexa488-SS18) formó espontáneamente gotas de tamaño micrométrico en un tampón de formación de gotas. Las gotas, de manera dependiente de la concentración de proteínas, crecieron en número y tamaño, un fenómeno característico de LLPS (Fig. 3b). Además, la formación de gotas condensadas se suprimió en gran medida cuando se añadió 1,6-hexanodiol al 5% a la solución, lo que sugiere que en el proceso están involucradas interacciones hidrófobas. El 1,6-hexanodiol es una molécula alifática que altera los conjuntos de separación de fases inducidos por interacción hidrofóbica tanto in vitro como in vivo25,26,27. El análisis posterior de microscopía óptica reveló que las gotas esféricas SS18 también experimentan eventos de fusión dinámica, lo que es indicativo de propiedades dinámicas similares a las de un líquido (Fig. 3c). Durante la purificación de proteínas, descubrimos que las diferentes condiciones de almacenamiento de proteínas, como la temperatura, pueden hacer que las soluciones de proteínas SS18 se vuelvan opalescentes. Por lo tanto, separamos la fase líquida condensada de las soluciones acuosas a granel mediante centrifugación y descubrimos que el LLPS de SS18 puede ocurrir en un amplio rango de temperaturas (4-37 °C analizado)28. Las temperaturas más bajas pueden promover la transición de fase de SS18 (Fig. 3d, e).

a Análisis de la secuencia de la proteína de 387 aminoácidos SS18. Dominios conocidos SNH y QPGY. La línea roja predice la puntuación de las regiones intrínsecamente no estructuradas (IUPred) para tendencias intrínsecamente desordenadas; >0,5 se considera desordenado. b Imágenes de fluorescencia y campo brillante de las gotitas SS18 en diferentes concentraciones de proteína. Se añadió 1,6-hexanodiol (Hex, 5%) a la proteína SS18 (60 µM) para interrumpir la formación de gotitas. Las gotas de líquido están enriquecidas en SS18 marcado con Alexa Fluor 488 (relación molar de 1:100 de SS18 marcado y no etiquetado). Esta proporción de etiquetado de proteínas se utilizó durante todo el estudio a menos que se indique lo contrario. La barra de escala indica 10 μm. c Las pequeñas gotas se sometieron a una fusión dinámica dependiente del tiempo en el tampón compuesto por Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM a temperatura ambiente. Análisis representativo de SDS-PAGE (d) y datos de cuantificación e que muestran la distribución de proteínas entre la solución acuosa/sobrenadante (S) y las fracciones de gotas/pelets de líquido condensado (P) para la proteína SS18 (30 µM) a diferentes temperaturas. Las intensidades de las bandas de las proteínas se cuantificaron con el software Image J v1.8.0. Los datos cuantitativos representan resultados de tres lotes independientes de experimentos de sedimentación y se representan como media ± SEM. f Imágenes de células vivas (GFP) e imágenes de contraste de fase simultáneas para GFP-SS18 y GFP-SNF11 en células HEK293T. La barra de escala indica 5 μm. g Imágenes FRAP de lapso de tiempo representativas que muestran que la señal de GFP-SS18 dentro de los puntos se recuperó en unos pocos segundos en las células HeLa. Los cuadros rojos muestran las regiones ampliadas. h Curvas de recuperación de FRAP para seis puntos GFP-SS18 de seis células HeLa independientes con barras de error que indican la media ± SEM. El tiempo 0 se refiere al punto temporal del pulso de fotoblanqueo.

Para probar si SS18 puede sufrir LLPS en líneas celulares vivas, se expresó transitoriamente SS18 exógeno marcado con GFP (GFP-SS18) en células HEK293T. En particular, GFP-SS18 mostró un patrón puntiforme característico en los núcleos con focos que oscilaban entre 0,2 y 1 µm de tamaño, lo que concuerda con las observaciones de estudios anteriores29,30. Por el contrario, el SNF11 marcado con GFP (GFP-SNF11), que carece de regiones intrínsecamente desordenadas, se distribuye de forma difusa por toda la célula (Fig. 3f y Fig. 6a complementaria). Además, los experimentos de recuperación de señales de fluorescencia después del blanqueo (FRAP) en células HeLa mostraron que aproximadamente el 72,8% de las moléculas de GFP-SS18 en los focos se intercambiaban con sus contrapartes en el disolvente circundante, con un tiempo medio de recuperación promedio de 6,9 ​​s (Fig. 3g,h). Este resultado indicó que SS18 se condensa en gotitas en fase líquida formadas como puntos en las células. En conjunto, SS18 formó gotitas separadas en fases in vitro y condensados ​​dinámicos similares a líquidos in vivo.

El dominio QPGY de SS18 está compuesto predominantemente de glutamina, prolina y glicina, con residuos de tirosina que aparecen a intervalos variables y forman homooligómeros9. Teniendo en cuenta el papel emergente de las interacciones multivalentes entre los residuos de tirosina en la proteína LLPS, mutamos 21 residuos de tirosina a serina en la región intrínsecamente desordenada de SS18, aquí denominada SS18 (Y21S), para interrumpir la multimerización de SS18 (Figura complementaria 3). )18,24. Como se esperaba, el análisis co-IP mostró que el mutante SS18 (Y21S) pierde su capacidad de autoasociación (carril 4 en comparación con el carril 2 en la Fig. 4a). En comparación con la proteína SS18 de tipo salvaje (SS18-WT), los experimentos de sedimentación mostraron que todas las proteínas mutantes SS18 (Y21S) permanecen en el sobrenadante acuoso después de la centrifugación (carriles 5 y 6 en comparación con los carriles 1 y 2 en la Fig. 4b). , C). De acuerdo con esta observación, las proteínas SS18 (Y21S) purificadas mostraron una distribución difusa en las células HEK293T y no pudieron formar gotas (Fig. 4d, e). Para examinar más a fondo el efecto de los residuos de tirosina en la separación de fases, el dominio QPGY de SS18 se fusionó con el carboxilo terminal de SNF11, y esta quimera se denominó SNF11-QPGY. Las figuras complementarias 5e, f proporcionan varias líneas de evidencia que demuestran que la quimera SNF11-QPGY también podría sufrir una separación de fases a través de la autoasociación mediada por el dominio QPGY. En conjunto, estos resultados indicaron que la multimerización mediada por residuos de tirosina es importante para la separación de fases SS18.

Experimentos Co-IP que prueban la capacidad de autoasociación de SS18 o sus mutantes. Se prepararon extractos a partir de células HEK293T transfectadas con combinaciones de plásmidos, como se indica. El panel inferior muestra el 3% del Myc-SS18 como entrada para cada IP. Análisis SDS-PAGE representativo (b) y datos cuantitativos (c) para el ensayo de sedimentación de SS18 WT, mutantes o varias mezclas de SS18/BRG1(1-282), como se indica. La concentración de cada proteína es de 60 µM. Las intensidades de las bandas de las proteínas se cuantificaron con el software Image J v1.8.0. Los datos estadísticos representan resultados de tres lotes independientes de experimentos de sedimentación y se representan como media ± SEM. d Imágenes de fluorescencia y campo brillante de SS18 WT o gotitas mutantes a una concentración de proteína de 60 µM. Las gotas de líquido están enriquecidas en SS18 WT o mutante marcado con Alexa Fluor 488. La barra de escala indica 10 μm. e Imágenes de fluorescencia representativas de GFP-SS18 (WT), GFP-SS18 (Y21S) y GFP-SS18 (3M) en células HEK293T. La barra de escala indica 5 μm. f Co-localización de GFP-SS18-WT o mutantes y Cherry-BRG1 en células HEK293T. La barra de escala indica 5 μm. g Imágenes representativas de fluorescencia y campo brillante de la mezcla de SS18 o mutantes marcados con Alexa Fluor 488 (60 µM) y BRG1(1-282) marcado con Cy3 (60 µM) en el tampón compuesto por Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM a temperatura ambiente. La barra de escala indica 10 μm.

Como subunidad catalítica de varios complejos de remodelación de cromatina, BRG1 se une específicamente al dominio SNH de SS18, como se vio anteriormente en la Fig. 1. Por lo tanto, inferimos que los condensados ​​nucleares de SS18 podrían compartimentar BRG1. Para probar esta hipótesis, expresamos GFP-SS18 junto con BRG1 (Cherry-BRG1) etiquetado con mCherry en células HEK293T. Como era de esperar, encontramos que BRG1 se recluta fácilmente dentro de los condensados ​​nucleares de SS18 cuando se coexpresa con SS18, pero demuestra una distribución difusa en el núcleo cuando SS18 está ausente (Fig. 4f). Curiosamente, cuando se coexpresó con el mutante SS18 (3M), BRG1 se separó completamente de los concentrados (Fig. 4f). Estos resultados son consistentes con las observaciones que muestran que el mutante SS18 (3M) no puede unirse a BRG1 como se mostró anteriormente en la Fig. 1d, pero es capaz de realizar LLPS (Fig. 4b-e). Además, encontramos que BRG1 se colocaliza de manera difusa con el mutante SS18 (Y21S) que contiene la incapacidad de LLPS, pero es capaz de unirse a BRG1 (Fig. 4f). Descubrimos consistentemente que BRG1 (1-282) está enriquecido dentro de los condensados ​​SS18-WT o sedimentados con SS18-WT, mientras que el mutante SS18 (3M) no puede reclutar BRG1 (1-282) en las gotas ni sedimentar BRG1 (1). -282) (Figura 4b, c, g). El mutante SS18(Y21S) se utilizó como control ya que no podía formar gotas ni sedimentos sobre sí mismo ni sobre BRG1(1-282). En conjunto, estos datos sugieren que la separación de fases de SS18 conduce al enriquecimiento de BRG1 en condensados ​​nucleares a través de la interacción específica entre SS18 y BRG1.

Como se mencionó anteriormente, la proteína de oncofusión SS18-SSX1 contiene casi todo el dominio QPGY de SS18 y conserva la capacidad de incorporarse de manera estable en el complejo CBAF a través de la unión del dominio SNH a BRG1 (Fig. 1 y Fig. Suplementaria 4a) 13. Además, el dominio de represión (dominio RD) de SSX1 puede reclutar específicamente reguladores transcripcionales para loci genómicos específicos14,31. Un análisis de IUPred indicó que la región carboxilo, incluidos los dominios QPGY y RD, de SS18-SSX1 también está intrínsecamente desordenada (Figura complementaria 6b). Debido a estas observaciones, nos gustaría probar si SS18-SSX1 aún conserva la capacidad de separación de fases y distinguirlo del SS18, que se expresa ampliamente en células y tejidos normales. Primero, encontramos que las proteínas de fusión SS18-SSX1 purificadas no forman gotitas condensadas en las mismas composiciones de solución y concentración de proteínas que las de SS18. Curiosamente, notamos que la solución SS18-SSX1 se vuelve turbia y que la formación de gotas ocurre de manera dependiente de la concentración, cuando el tampón contenía un 10% de Ficoll, imitando el ambiente abarrotado del núcleo (Fig. 5a). Además, las gotas pequeñas se fusionan gradualmente en otras más grandes dentro de los primeros 15 s (Fig. 5b). También observamos que aproximadamente el 40% de las proteínas SS18-SSX1 se recuperaron de la fase condensada (fracciones de pellets) en presencia de un 10% de Ficoll (carriles 7 y 8 en la Fig. 5c, d). En combinación con Ficoll al 10%, el 1,6-hexanodiol (5% Hex) conduce a la dispersión de la fase condensada (carriles 13 y 14 en comparación con los carriles 7 y 8 en la Fig. 5c, d). Sin embargo, encontramos que el SSX1 (111-188) purificado en sí no puede someterse a LLPS en las mismas condiciones que la proteína SS18-SSX1 (Figura complementaria 6c). En conjunto, estos resultados sugirieron que la proteína de oncofusión SS18-SSX1 sufre LLPS in vitro en presencia de reactivos de apiñamiento.

a Imágenes de fluorescencia representativas de la proteína de fusión SS18-SSX1 en diferentes concentraciones de proteína. Las gotas de líquido están enriquecidas con SS18-SSX1 etiquetado con Alexa Fluor 488. El tampón de formación de gotitas comprende Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y Ficoll al 10 %. Las barras de escala indican 10 µm. b Imágenes de contraste de fase de la proteína SS18-SSX1 en diferentes momentos para mostrar la fusión dinámica de dos gotitas. Análisis SDS-PAGE representativo (c) y datos cuantitativos (d) del ensayo de sedimentación de la proteína SS18-SSX1 o mutantes en el tampón con o sin Ficoll al 10%. Se añadió 1,6-hexanodiol (Hex, 5%) a la proteína SS18-SSX1 para interrumpir la formación de gotas. La concentración de cada proteína es de 60 µM. Las intensidades de las bandas de las proteínas se cuantificaron con el software Image J v1.8.0. Los datos estadísticos representan los resultados de tres lotes independientes de experimentos de sedimentación y se representaron como media ± SEM. e Imágenes representativas de fluorescencia y campo brillante de la mezcla de SS18-SSX1 marcado con Alexa Fluor 488 o mutantes (60 µM) y BRG1(1-282) marcado con Cy3 (60 µM) en el tampón compuesto por Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM y Ficoll al 10% a temperatura ambiente. La barra de escala indica 10 μm. f Imágenes de células vivas para GFP-SS18-SSX1, GFP-SS18(3M)-SSX1 y GFP-SS18(Y19S)-SSX1 en células HEK293T y HS-SY-II. La barra de escala indica 5 μm. g Curvas de recuperación de FRAP para puntos GFP-SS18-SSX1, GFP-SS18 (3M) -SSX1 y GFP-SS18 (Y19S) -SSX1 de tres células HeLa independientes con barras de error que indican la media ± SEM. El tiempo 0 se refiere al punto temporal del pulso de fotoblanqueo. h Coexpresión de GFP-SS18-SSX1 o mutantes y Cherry-BRG1 en células HEK293T y HS-SY-II. La barra de escala indica 5 μm.

A continuación, intentamos probar la capacidad de separación de fases de dos mutantes SS18(3M)-SSX1 y SS18(Y19S)-SSX1, en los que contenían tres mutaciones (I32E, L54E y A65E) y 19 residuos de tirosina mutados a serina en SS18. , respectivamente (Fig. 1a y Fig. complementaria 3). Como se anticipó, se recuperó una cantidad similar de las proteínas mutantes SS18 (3M) -SSX1 y SS18-SSX1-WT de la fase condensada (carriles 9 y 10 en comparación con los carriles 7 y 8 en la Fig. 5c, d). Estos resultados son congruentes con análisis co-IP anteriores en la Fig. 4b complementaria, que indica que los mutantes SS18 (3M) -SSX1 y SS18-SSX1-WT son capaces de autoasociarse (Fig. 4b complementaria). Además, el mutante SS18(Y19S)-SSX1 no se recuperó de la fase condensada, lo que demuestra además que las interacciones multivalentes mediadas por residuos de tirosina del dominio QPGY de SS18 son la fuerza impulsora del LLPS de SS18-SSX1 (carriles 11 y 12). en la figura 5c, d). También es importante tener en cuenta que solo el SS18-SSX1 de tipo salvaje puede reclutar BRG1 (1-282) en las gotas condensadas (Fig. 5e). A pesar de tener la capacidad de unirse a BRG1, el mutante SS18 (Y19S) -SSX1 no pudo formar gotas condensadas, mientras que el mutante SS18 (3M) -SSX1 pudo formar gotas condensadas, pero no pudo reclutar BRG1 (Fig. 5e ). Posteriormente, observamos que tanto SS18-SSX1 como el mutante SS18(3M)-SSX1 muestran un cluster tipo puncta más denso, distribuido en las células HEK293T y en la línea celular de sarcoma sinovial HS-SY-II o CME-1, en comparación con Puntos SS18 mostrados anteriormente en la Fig. 4e (Fig. 5f y Fig. Suplementaria 4c). Por el contrario, el mutante SS18 (Y19S) -SSX1 se difundió en estas células y se observó una pequeña cantidad de agregación de proteínas (Fig. 5f y Fig. Suplementaria 4c). Para detallar las propiedades del grupo puncta, utilizamos FRAP para monitorear la tasa de intercambio de SS18-SSX1 o dos moléculas mutantes en el grupo puncta con sus contrapartes en el solvente a granel circundante. Después del blanqueo, aproximadamente entre el 54% y el 58% de la señal de los puntos GFP-SS18-SSX1 y GFP-SS18(3M)-SSX1 se recuperaron dentro de un tiempo de vida media promedio de 38,7 s y 49,8 s, respectivamente, que es más lento que el de SS18. (Figuras 3h y 5g). En particular, aproximadamente el 76 % de la fluorescencia de GFP-SS18(Y19S)-SSX1 en el grupo se recuperó en un tiempo de vida media promedio de 28,2 s, lo que indica que las mutaciones de tirosina a serina en el dominio QPGY conducen a características más dinámicas de este mutante (Fig. 5g). El mutante SS18(3M)-SSX1 demostró su incapacidad para colocarse con BRG1, mientras que SS18-SSX1-WT pudo reclutar BRG1 en los condensados ​​de fases separadas en las células HEK293T y en la línea celular de sarcoma sinovial HS-SY-II o CME-1. (Fig. 5h y Fig. complementaria 4d). Además, se observó que el mutante SS18 (Y19S) -SSX1, que tiene la incapacidad de separación de fases, también tiene una distribución difusa de BRG1 en las líneas celulares (Fig. 5h y Fig. Suplementaria 4d). En conjunto, estos resultados indicaron que la oncofusión SS18-SSX1 recluta BRG1 en condensados ​​de fases separadas a través de interacciones específicas entre SS18-SSX1 y BRG1.

A continuación, queríamos explorar el papel de la separación de fases SS18-SSX1 y la unión de BRG1 en el desarrollo de SyS. Para abordar esto, reconstituimos tres líneas celulares de fibroblastos NIH3T3 que sobreexpresan de manera estable SS18-SSX1, SS18 (3M) -SSX1 y SS18 (Y19S) -SSX1. Los resultados de la transferencia Western mostraron que los niveles de expresión de SS18-SSX1, SS18 (3M) -SSX1 y SS18 (Y19S) -SSX1 en cada línea celular eran comparables y aumentaron significativamente en comparación con el control (Fig. 6a). Para probar el papel de SS18-SSX1 en la tumorigénesis, realizamos ensayos clonogénicos y de proliferación celular EdU para detectar la síntesis de ADN y la capacidad de formación de clones. En particular, los experimentos de proliferación de EdU demostraron que, en comparación con el control, la sobreexpresión de WT SS18-SSX1 promueve eficientemente la proliferación de células NIH3T3, mientras que ambos mutantes SS18(3M)-SSX1 y SS18(Y19S)-SSX1 exhiben una deficiencia parcial en la promoción de la proliferación celular (Fig. 6b, c). Los experimentos de formación de colonias determinaron que las células NIH3T3 que expresan los mutantes SS18 (3M) -SSX1 o el mutante SS18 (Y19S) -SSX1 forman pocos clones y más pequeños en comparación con el tipo salvaje (Fig. 6d). Además, probamos las capacidades de migración e invasión de las células NIH3T3 expresadas de manera estable WT SS18-SSX1, así como de mutantes. Estos resultados mostraron que WT SS18-SSX1, pero no los mutantes, promueven tanto la migración como la invasión de células NIH3T3 (Fig. 6e-h). En conjunto, estos resultados indicaron que la separación de fases de la oncoproteína SS18-SSX1 y su ensamblaje en complejos de remodelación de cromatina son importantes para su actividad transformadora en las células de fibroblastos NIH3T3.

a El nivel de proteína de SS18-SSX1 WT o mutantes sobreexpresados ​​en células NIH3T3. b Ensayo EdU de líneas celulares NIH3T3 sobreexpresadas SS18-SSX1 WT o mutantes. Los núcleos positivos para EdU (marcados con azida Alexa Fluor 488; verde) y los núcleos teñidos con 1 × Hoechst de todas las células (azul) se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia. c Gráfico estadístico del ensayo EdU en (b). Las barras de error representan la media ± SEM, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey; n = 5 experimentos independientes, ****P < 0,0001. d Formación de colonias en placa de líneas celulares NIH3T3 que sobreexpresan SS18-SSX1 WT y mutantes. Las colonias se tiñeron con cristal violeta al 0,1%. Ensayo de migración celular (e) e invasión g de líneas celulares NIH3T3 que sobreexpresan SS18-SSX1 WT y mutantes. Las células se tiñeron con cristal violeta al 1% y se visualizaron mediante microscopía de campo brillante. f, h Gráfico estadístico del ensayo de migración e invasión celular. Las barras de error representan la media ± SEM, ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey; n = 3 experimentos independientes, ****P < 0,0001.

En este estudio, encontramos que el SS18 humano se une a BRG1 y el SNF11 de levadura se une a SNF2, el homólogo de levadura de BRG1, con una estructura de heterodímero similar (Figs. 1b y 2b y Fig. Suplementaria 5d). Esto indica la conservación entre SNF11 y el dominio SNH N-terminal de SS18. Con esta observación y las similitudes de secuencia de SNF11 y el dominio SNH de SS18 en una amplia gama de especies, podemos concluir que SNF11 podría ser un homólogo de SS18 en S. cerevisiae (Figura complementaria 3). SS18 tiene una región extra intrínsecamente desordenada, incluido el dominio QPGY, que media en LLPS a través de interacciones hidrofóbicas multivalentes, mientras que su homólogo de levadura, SNF11, no tiene la capacidad de separación de fases (Fig. 3). Además, la quimera SNF11-QPGY también demostró sufrir una separación de fases (Figura complementaria 5e, f). Teniendo esto en cuenta, especulamos que SS18 adquirió una característica de separación de fases para participar en funciones fisiológicas específicas en Chordata en el proceso de evolución. Curiosamente, un estudio reciente demostró que SS18 media el ensamblaje de CBAF a través de la separación de fases para regular la transición somática pluripotente, de acuerdo con nuestra especulación32. En su estudio, los autores encontraron que una región C-terminal intrínsecamente desordenada de SS18 regula la formación de condensados ​​microscópicos bajo la condición de sobreexpresión ectópica, y que el N-terminal 70aa de SS18 es necesario para su unión a CBAF. Estas observaciones son consistentes con nuestros resultados. Además, utilizamos proteínas recombinantes purificadas para confirmar el LLPS de SS18 in vitro y revelamos la base estructural de la interacción entre SS18 y BRG1.

Evaluamos la separación de fases de SS18 o SS18-SSX1 en células vivas utilizando sistemas de sobreexpresión ectópica (Figs. 3-5). Además, observamos que el SS18 endógeno o SS18-SSX1 muestra una distribución tipo puncta similar en células madre embrionarias de ratón o sarcoma sinovial a la sobreexpresión en HeLa, HEK293T o células de sarcoma sinovial30,32 (Figs. 3-5). ). Sin embargo, es innegable que el LLPS es un proceso que depende de la concentración. Aunque es difícil evaluar el LLPS en sistemas de estado nativo33, se necesitan estudios futuros para validar el LLPS SS18 o SS18-SSX1 en un sistema in vivo apropiado.

Nuestros resultados mostraron que las características de las gotas/condensados ​​formados por SS18 y SS18-SSX1 son ligeramente diferentes, aunque la fuerza impulsora para someterse a LLPS es similar (Figs. 3-5). Específicamente, SS18-SSX1 en comparación con SS18 puede formar gotitas separadas en fases solo en presencia de una cierta concentración de reactivo de apiñamiento. Además, se ha demostrado que las moléculas fluorescentes SS18-SSX1 se intercambian a un ritmo mucho más lento que SS18 con sus homólogos en el disolvente a granel (Figs. 3 y 5). Estos resultados sugirieron que el socio de fusión SSX1 (111-188) podría contribuir o regular el LLPS de la oncofusión SS18-SSX1. También se ha informado que las proteínas SSX se distribuyen de manera difusa en los núcleos de las células SyS o de fibrosarcoma, junto con algunos puntos nucleares34,35. Consistentemente, nuestros resultados mostraron que el SSX1 (111-188) purificado en sí no puede ocurrir en la separación de fases in vitro (Figura complementaria 6c). Debido a esto, aún es necesario estudiar más a fondo el mecanismo exacto del SSX1 (111-188) para regular la separación de fases de SS18-SSX1 y su significado biológico subyacente.

Se cree que la desregulación de los sistemas reguladores de genes basados ​​en la cromatina es un factor central de la patogénesis del SyS36. Un estudio anterior señaló una capacidad interesante de SS18-SSX, que recluta el complejo represivo 2 de Polycomb (PRC2) en genes diana de ATF2 para reprimir genes supresores de tumores codificados por el locus CDKN2A37. Por otro lado, otros estudios sugieren que SS18-SSX altera la distribución del genoma BAF y los niveles de subtipo y, por lo tanto, aumenta la capacidad del complejo para alterar la función de PRC2. Esta alteración podría mediar la activación de la expresión génica a través de la familia COMPASS de metilasas de histonas H3K4 y orquestar programas transcripcionales oncogénicos aberrantes13,38,39. Un estudio de Banito et al. descubrieron que las fusiones SS18-SSX se asocian con KDM2B-PRC1.1, un complejo represivo de Polycomb 1 no canónico, para activar de manera aberrante factores de transcripción que son objetivos de la represión genética mediada por Polycomb40. Investigaciones posteriores aclararon que la conformación específica SS18-SSX de los complejos BAF exhibe una fuerte preferencia por los nucleosomas marcados con H2AUbK119, lo que respalda su preferencia por las regiones de cromatina decoradas con policombos31. Estas observaciones, junto con nuestros resultados, sugieren que la separación de fases es un mecanismo importante. Este mecanismo permite que los condensados ​​SS18-SSX1 funcionen como centros en los complejos de remodelación de la cromatina compartimentados de una manera eficiente y específica que impulsa la sarcomagénesis sinovial. Se necesitan estudios futuros para detallar más el efecto y el papel de SS18-SSX LLPS en un modelo animal.

Dirigirse a los mecanismos relacionados con LLPS para tratar una variedad de enfermedades es una idea prometedora41. Por ejemplo, se desarrolló un inhibidor de molécula pequeña de la actividad nuclear de PARP-1/2 para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) reduciendo la formación de agregados citoplasmáticos de TDP-43 en células de mamíferos42. Teniendo en cuenta nuestros resultados y estos estudios previos, las moléculas pequeñas dirigidas a la separación de fases de SS18-SSX1 podrían ser una forma atractiva de terapia para SyS.

Se amplificaron SS18 humano (residuos 1–387, SS18(1-387)), SNF11 de levadura (residuos 1–169, SNF11(1-169)) y SNF2 de levadura (residuos 248–308, SNF2(248-308)). mediante PCR a partir de la biblioteca de ADNc de la línea celular HEK293T y del ADN del genoma de Saccharomyces cerevisiae, respectivamente. La BRG1 humana se adquirió de Addgene (Plasmid #1959). SSX1 y SS18 (Y21S) se obtuvieron mediante síntesis de genes (GENEWIZ). Las mutaciones se generaron utilizando un método de mutagénesis estándar basado en PCR y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Para producir una proteína de fusión monocatenaria de BRG1 (172–213) y SS18 (14–101), se amplificaron fragmentos de ADN mediante PCR y se unieron con un segmento escindible por proteasa TEV (Glu–Asn–Leu–Tyr–Phe– Gln-Ser). Se insertaron dos aminoácidos (Ser-Gly) en ambos lados del segmento TEV. Luego, la cadena sencilla se clonó en una versión modificada interna del vector pET32a (Novagen, 69015-3CN) y la proteína resultante contenía una etiqueta tiorredoxina (Trx)-his6 en su extremo N-terminal. SNF11(38-169) y SNF2(248-308) se clonaron en dos sitios de clonación múltiples del vector pETDuet-1 (Novagen, 71146-3) por separado y secuencialmente. Para las proteínas estudiadas en separación de fases: SS18-SSX1, SS18(3M)-SSX1, SS18(Y19S)-SSX1 y BRG1(1-282) se clonaron en una versión modificada interna del vector pET32a. Las proteínas resultantes contenían una etiqueta Trx-his6 en el extremo N. SS18, SS18(3M) y SS18(Y21S) se clonaron en una versión modificada interna del vector pET32a con una etiqueta his6 de proteína de unión a maltosa (MBP) en el extremo N (Tabla complementaria 2).

Se cultivaron células BL21(DE3) Codon Plus Escherichia coli que albergaban el plásmido de expresión en medio LB a 37 °C hasta que la DO600 alcanzó 0,6 y se indujo la expresión de la proteína con isopropil-β-d-tiogalactósido 300 µM (Chemsynlab, A04283) a 16ºC. °C durante 16 a 18 h. La proteína sustituida con Se-Met se expresó en células de E. coli B834 (DE3) auxotróficas con metionina cultivadas en medio LeMaster. Las proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad en agarosa Ni2+-NTA seguida de cromatografía de exclusión por tamaño en un HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare) en MES 50 mM, pH 6,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM y DTT 1 mM. Después de la digestión con PreScission Protease para escindir la etiqueta N-terminal Trx-his6, la proteína objetivo se purificó aún más en una columna de intercambio aniónico HiTrap SP HP. El paso de purificación final fue la cromatografía de exclusión por tamaño en una columna de aumento Superdex 200 10/300 (GE Healthcare) en MES 50 mM, pH 6,0, NaCl 100 mM y DTT 1 mM.

Los experimentos de SV se realizaron en una ultracentrífuga analítica Beckman Coulter XL-I (Beckman Coulter) utilizando centros de mesa de doble sector y ventanas de zafiro. Las proteínas se cambiaron al tampón que contenía MES 50 mM, pH 6,0, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM y DTT 1 mM mediante una columna de aumento Superdex 200 10/300 antes de los experimentos. Los experimentos de SV se realizaron a 4 °C utilizando detección de luz de interferencia. Los datos de VS se analizaron mediante el programa SEDFIT v14.043,44.

Tanto los cristales nativos como los sustituidos con Se-Met del complejo humano BRG1(172-213)-SS18(14-101) se obtuvieron mediante el método de difusión de vapor en gota sentada a 20 °C. Los cristales se cultivaron en la solución que contenía fosfato monobásico de sodio 1,16 M y fosfato dibásico de potasio 0,24 M a una concentración de proteína de 40 mg/ml. Se cultivaron cristales nativos del complejo de levadura SNF11(38-169)/SNF2(248-308) a 20 °C a una concentración de proteína de 7 mg/ml utilizando el mismo método que el anterior. La proteína se equilibró frente a una solución reservorio de fosfato monobásico de sodio 0,79 M y fosfato dibásico de potasio 0,61 M. Para obtener información de fase, los cristales de SNF11(38-169)/SNF2(248-308) se empaparon en acetato de mercurio (II) 2 mM (Hampton, HR2-446) durante 30 min. Todos los cristales se enfriaron criogénicamente en la solución precipitante que contenía glicerol al 25 % (v/v) utilizando nitrógeno líquido y todos los datos de difracción se recogieron en la Instalación de Radiación Sincrotrón de Shanghai (SSRF) en las líneas de luz BL19U145 y se procesaron utilizando el paquete de software HKL2000 v71446.

La fase y la construcción del modelo inicial de la estructura cristalina compleja humana BRG1 (172-213) -SS18 (14-101) se determinaron mediante dispersión anómala de longitud de onda única (SAD) utilizando PHENIX v1.15-2155 AutoSol Wizard47 y AutoBuild Wizard48, respectivamente. Las fases iniciales y los modelos del complejo de levadura SNF11(38-169)/SNF2(248-308) fueron determinados por SAD utilizando el programa Shelx C/D/E49 en CCP4i v7.0.073. Luego, los modelos iniciales se reconstruyeron y ajustaron manualmente con el programa Coot v0.8.350 y se refinaron con el programa de refinamiento Phenix v1.15-2155 (https://www.phenix-online.org/). El modelo final se validó adicionalmente utilizando MolProbity51. Las estadísticas detalladas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en la Tabla complementaria 1. Todas las figuras estructurales se prepararon utilizando PyMOL v1.6 (//www.pymol.org/) y el gráfico plano de la interacción proteína-proteína se generó mediante Ligplot+ v2. 2 software52.

Células HEK293T (CBTCCCAS, GNHu17), células HeLa (CBTCCCAS, TCHu187), células NIH3T3 (CBTCCCAS, SCSP-515) y células HS-SY-II (de Hiroshi Sonobe, Departamento de Patología, Facultad de Medicina de Kochi, Nankoku, Japón) se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (Sigma-Aldrich, D6429) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Biological Industries, 04-010-1 A), 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina (Hyclone, SV30010) almacenados. en una incubadora que contiene 5% de CO2 a 37 °C. Se cultivaron células CME-1 (de Nicolo Riggi, División de Patología Experimental, Instituto de Patología, Centro Hospitalario Universitario Vaudois y Universidad de Lausana, Lausana, Suiza) en RPM1 1640 que contenía suero bovino fetal al 10% y penicilina-estreptomicina. Los plásmidos se transfectaron con polietilenimina (Polysciences, 02371-500) según el protocolo del fabricante. Para los plásmidos implicados en líneas celulares de sobreexpresión estable, los genes mutantes y SS18-SSX1 de tipo salvaje se subclonaron en el vector de expresión pSIN-EF2-Pur (Addgene, plásmido n.º 16579) con una etiqueta Myc N-terminal, denominada pSIN- EF2-SS18-SSX1, pSIN-EF2-SS18(3M)-SSX1 y pSIN-EF2-SS18(Y19S)-SSX1 (Tabla complementaria 2). Para preparar partículas lentivirales, se transfectaron el vector recombinante junto con el vector de empaquetamiento pSPAX2 y el vector de envoltura que expresa el virus PMD2.G en células HEK293T. Se sembraron células NIH3T3 en placas de 6 pocillos y se infectaron con diferentes virus al día siguiente, y se agregaron 10 µg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich, H9268) para aumentar la eficacia de la infección. Después de 48 h de infección, se utilizó un medio nuevo que contenía 1,5 µg/ml de puromicina (Solarbio, P8230) para detectar clones positivos. Se seleccionaron clones positivos para establecer la expresión estable de las líneas celulares del vector vacío, SS18-SSX1, SS18(3M)-SSX1 o SS18(Y19S)-SSX1. Las proteínas de control de carga en cada línea celular se examinaron mediante transferencia Western con anticuerpo GAPDH conjugado con HRP (Proteintech, HRP-60004) con una dilución de 1:10.000.

Se transfectaron células HEK293T con las combinaciones de plásmidos indicadas. Después de 24 h de transfección, las células HEK293T se lisaron utilizando un tampón de lisis celular helado (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 8 % de glicerol, 0,5 % de NP40, 0,5 % de Triton X-100, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y cócteles inhibidores de proteasa) y se aclararon por centrifugación a 11.750 xg durante 20 min a 4 °C. Luego, los sobrenadantes se incubaron con anticuerpos anti-GFP conjugados con agarosa durante 30 minutos a 4 °C. Las perlas de agarosa se lavaron tres veces con tampón de lisis celular y eluyeron con tampón de muestra SDS. Luego, las muestras se sometieron a SDS-PAGE y análisis de transferencia Western.

Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, IPVH00010). Posteriormente, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 10% en TBST (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,1%) durante 1 h. Las membranas de PVDF se inmunotransfirieron con anticuerpo anti-Myc (Sigma-Aldrich, M4439) diluido 1:5000 y anticuerpo anti-GFP (Sigma-Aldrich, G1544) diluido 1:5000 a temperatura ambiente durante 1 h, y luego se sondaron con anticuerpo anti-Cabra. -IgG-HRP de ratón (Santa Cruz, sc-2005) o IgG-HRP de cabra anti-conejo (Santa cruz, sc-2004) con una dilución de 1:5000, respectivamente, y desarrollados con un sustrato quimioluminiscente (Millipore, WBKLS0500) . Las bandas de proteínas se visualizaron en el sistema de imágenes quimioluminiscentes Tanon-5200 (Tanon Science and Technology).

Se prepararon proteínas SS18 y BRG1(1-282) purificadas en tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM. La proteína SS18-SSX1 se diluyó a la concentración deseada en el tampón de formación de gotitas (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y Ficoll al 10%). La formación de separación de fases se analizó directamente mediante métodos basados ​​en imágenes o mediante experimentos de sedimentación28. La observación y caracterización de las gotas se llevaron a cabo en un microscopio de fluorescencia (LEICA CTR5000) y los datos se recopilaron mediante el software Leica Application Suite v4.4.0. Para el etiquetado fluorescente de proteínas, se incubaron el éster Alexa488-NHS (Yeasen, 40779ES03) y el éster Cy3-NHS (Yeasen, 40777ES03) con SS18 o SS18-SSX1 y BRG1(1-282), respectivamente, a temperatura ambiente durante 1 h. La relación molar de fluoróforo a proteína fue de 2:1 y el pH de la solución se ajustó a pH 8,3 con NaHCO3 100 mM. La reacción se detuvo mediante Tris-HCl 200 mM, pH 8,3. Las proteínas marcadas se cambiaron aún más al tampón (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 y NaCl 150 mM) mediante la columna de desalinización Hitrap (GE Healthcare).

Se cultivaron células HEK293T, HS-SY-II y CME-1 en placas con fondo de vidrio (Nest, 801002) y se transfectaron con los plásmidos indicados como se describe anteriormente. Después de 24 h de transfección, se tomaron imágenes de las células utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM710 con una lente de inmersión en aceite ×63, y luego los datos se recopilaron y procesaron mediante el software Zen Black v2011. Para el ensayo FRAP, también se cultivaron células HeLa en placas con fondo de vidrio y se transfectaron con los plásmidos indicados como se describe anteriormente. El ensayo FRAP también se realizó en un microscopio confocal Zeiss LSM710 a 37 °C. La señal de fluorescencia de GFP se blanqueó utilizando un rayo láser de 488 nm. La diferencia de intensidad de fluorescencia entre el preblanqueo y el tiempo 0 (el momento justo después del pulso de fotoblanqueo) se normalizó al 100%.

La proliferación de células se detectó mediante el ensayo de proliferación celular EdU según las instrucciones del fabricante. Se sembraron aproximadamente 1 x 105 células en placas de 12 pocillos y se mantuvieron durante 24 h antes del ensayo. Se añadió un total de 500 µl de reactivo EdU (10 µM) (Beyotime, C0071S) a cada pocillo y se incubó durante 2 h para marcar las células. Después de lavar tres veces con PBS, las células se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4% (Dingguo Biotechnology, AR-0211) durante 15 minutos, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,3% (GenStar, VA11410) durante otros 15 minutos y luego se incubaron con el reactivo de reacción de clic durante 30 minutos a temperatura ambiente en un ambiente oscuro. En total, se utilizó 1 × reactivo Hoechst33342 para contrateñir el núcleo. El resultado de la tinción se observó con un sistema de microscopio de fluorescencia Nikon ECLIPSE Ti-S y los datos se recopilaron mediante el software NIS-Elements F v4.0.

Las células NIH3T3 expresaron de manera estable el vector vacío o SS18-SSX1 de tipo salvaje, y sus mutantes se sembraron en placas de seis pocillos a 1,0 x 103 células por pocillo en medio de crecimiento suplementado con FBS al 10% y se incubaron a 37 °C durante 3 semanas. El medio de cultivo se cambió cada 3 a 5 días. Después de 3 semanas, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% (Dingguo Biotechnology, AR-0211) durante 30 minutos a temperatura ambiente y se tiñeron con cristal violeta al 0,1% (Sigma-Aldrich, V5265) durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego se lavaron las células. con agua y finalmente tomó una fotografía después de secar al aire. Estos experimentos se realizaron por triplicado.

Los ensayos de migración e invasión celular se llevaron a cabo utilizando un sistema de cámara Transwell de 24 pocillos (Corning, 3422). Un aparato Transwell se separó en compartimentos superior e inferior mediante filtros de policarbonato (poros de 8 μm). Para los ensayos de migración, las células NIH3T3 expresaron de manera estable el vector vacío o SS18-SSX1 de tipo salvaje, y sus mutantes (4,0 x 104) se suspendieron en 200 μl de medio de crecimiento en la cámara superior. Para los ensayos de invasión, los filtros de policarbonato se recubrieron con 300 μg/ml de matrigel (Corning, 356234) antes de la siembra celular. La cámara inferior contenía 750 μL de medio de crecimiento suplementado con 10% de FBS. Después de 24 h de incubación a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5%, las células de la superficie del filtro superior se eliminaron limpiando con un hisopo de algodón. Luego, los filtros se fijaron en paraformaldehído al 4% (Dingguo Biotechnology, AR-0211) y se tiñeron con cristal violeta al 0,1% (Sigma-Aldrich, V5265). Todas las células que migraron a la superficie del filtro inferior se contaron bajo un microscopio con un aumento de ×200. Cada ensayo se realizó por triplicado.

Cada experimento de filtración en gel analítico y SDS-PAGE (Figuras complementarias 1a-e y 5a, b), ensayos Co-IP (Figuras complementarias 1i, 4a, b y 5f) y ensayos de transferencia Western (Figura 6a) se realizaron dos veces de forma independiente con resultados similares y se mostró un resultado representativo. Para los datos de separación de fases, se adquirieron ensayos de formación de gotas in vitro (Figs. 3b, 4d, g y 5a, e) e imágenes confocales de células vivas (Figs. 3f, 4e, f y 5f, h) de tres experimento independiente, y se tomaron más de 6 imágenes para cada muestra. Mostraron resultados similares, por lo que se mostraron imágenes de microscopía representativas. El experimento de sedimentación (Figura complementaria 6c) se repitió tres veces con resultados similares. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism v8.0. Los datos se presentan como media ± SEM como se indica en las leyendas de las figuras. ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey, **** para P < 0,0001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

La secuencia de nucleótidos de la levadura SNF11 y SNF2 se obtuvo de las bases de datos del genoma de Saccharomyces cerevisiae con SGD ID de S00002480 y S00005816, respectivamente. Los datos de coordenadas atómicas y factores de estructura para la estructura cristalina del complejo BRG1/SS18 y SNF11/SNF2 se han depositado en la base de datos del Protein Data Bank con los códigos de acceso 7VRB y 7VRC, respectivamente. Los datos originales se proporcionan con este documento. Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en este artículo y sus archivos de información complementaria.

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Descargar referencias

Agradecemos al personal de la línea de luz BL19U1 de la Instalación Nacional para la Ciencia de las Proteínas en Shanghai (NFPS) en la Instalación de Radiación Sincrotrón de Shanghai por su ayuda durante la recopilación de datos y agradecemos a Wenxin Long por la edición en inglés. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 32171208 y 31870750 para HZ); por la Fundación de Ciencias Naturales de Tianjin [Subvención número 20JCYBJC01320 a JL]; por el programa de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (número de subvención JCYJ20210324122212034 a JL); y por Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales, Universidad de Nankai (Subvención número 030/63211052 a JL).

Laboratorio Estatal Clave de Biología Química Medicinal, Laboratorio Clave de Ciencias de las Proteínas de Tianjin y Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Nankai, 94 Weijin Road, 300071, Tianjin, China

Yanli Cheng, Zhongtian Shen, Yaqi Gao, Feilong Chen, Huisha Xu, Qinling Mo, Hao Zhou y Jiafu Long

Departamento de Epidemiología y Bioestadística, Instituto y Hospital del Cáncer de la Universidad Médica de Tianjin, 300060, Tianjin, China

Xinlei Chu

Departamento de Ortopedia, Segundo Hospital, Facultad de Medicina, Universidad de Shandong, 250033, Jinan, China

Chang-liang Peng

Departamento de Biología del Cáncer, Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas, Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas Facultad de Ciencias Biomédicas de Salud de UT, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Takese T. McKenzie, Bridgitte E. Palaces y Jian Hu

Instituto Internacional de Investigación Avanzada Nankai (Shenzhen Futian), 518045, Shenzhen, Guangdong, China

Jiafu largo

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YC, HZ y JL diseñaron la investigación. YC, ZS, FC, YG, HX, QM, XC, C.-LP, TTM y HZ realizaron investigaciones. YC, HZ y JL analizaron los datos y prepararon las cifras. YC, BEP, JH, HZ y JL escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito. JL coordinó la investigación.

Correspondencia a Hao Zhou o Jiafu Long.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Ernst Schönbrunn y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

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Recibido: 22 de octubre de 2021

Aceptado: 26 de abril de 2022

Publicado: 18 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30447-9

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