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Jul 04, 2023

Evaluación del sistema híbrido MxOy/fucoidan y su aplicación en el proceso de inmovilización de lipasas

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 7218 (2022) Cite este artículo 915 Accesos 4 Citas Detalles de métricas Una corrección del autor de este artículo se publicó el 23 de noviembre de 2022 Este artículo

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 7218 (2022) Citar este artículo

915 Accesos

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Detalles de métricas

Se publicó una corrección del autor de este artículo el 23 de noviembre de 2022.

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En este trabajo, se fabricaron y aplicaron nuevos sistemas híbridos MxOy/fucoidan en la inmovilización de lipasa. Se utilizaron óxidos de magnesio (MgO) y circonio (ZrO2) como matrices inorgánicas de MxOy. En el primer paso, los óxidos propuestos fueron funcionalizados con fucoidan de Fucus vesiculosus (Fuc). Los híbridos MgO/Fuc y ZrO2/Fuc obtenidos se caracterizaron mediante análisis espectroscópicos, incluyendo espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier, espectroscopia fotoelectrónica de rayos X y resonancia magnética nuclear. Además, se realizó análisis termogravimétrico para determinar la estabilidad térmica de los híbridos. Con base en los resultados, también se determinó el mecanismo de interacción entre los soportes de óxido y el fucoidan. Además, los materiales híbridos MxOy/fucoidan fabricados se utilizaron como soportes para la inmovilización de lipasa de Aspergillus niger, y se realizó una reacción modelo (transformación de palmitato de p-nitrofenilo en p-nitrofenol) para determinar la actividad catalítica del sistema biocatalítico propuesto. . En esa reacción, la lipasa inmovilizada exhibió una alta actividad aparente y específica (145,5 U/g de catalizador y 1,58 U/mgenzima para la lipasa inmovilizada en MgO/Fuc; 144,0 U/g de catalizador y 2,03 U/mgenzima para la lipasa inmovilizada en ZrO2/Fuc). La eficiencia de la inmovilización también se confirmó mediante análisis espectroscópicos (FTIR y XPS) y microscopía confocal.

En las últimas décadas, el desarrollo de materiales naturales económicos, biodegradables y fácilmente disponibles en diferentes aplicaciones ha sido de mayor interés para un gran número de investigadores. Es muy preferible que la matriz portadora que se une a la enzima pueda producirse de manera reproducible y no altere la actividad enzimática, porque tiene una gran importancia para el rendimiento tecnológico y el éxito comercial1,2,3. Sin embargo, esos materiales también tienen algunas desventajas (baja resistencia mecánica y estabilidad térmica limitada) que pueden mejorarse mediante un proceso de modificación adecuado4,5.

Los biopolímeros, debido a sus propiedades versátiles, incluida la no toxicidad, la biocompatibilidad, la biodegradabilidad, la flexibilidad y la renovabilidad, son portadores prometedores para la inmovilización de enzimas6,7,8. Además, en su estructura química están presentes numerosos grupos funcionales reactivos, como grupos hidroxilo, amino o ácido carboxílico. Estos permiten que las enzimas se conecten con esa estructura7,9. Hasta la fecha, se han utilizado como soportes enzimáticos diversos polisacáridos naturales como celulosa10,11, quitina12,13, quitosano14,15, alginato16,17, agarosa18,19,20 y carragenano21,22. Recientemente, se ha prestado más atención a los compuestos o híbridos de biopolímero/matriz inorgánica, que también pueden usarse en la inmovilización de enzimas7. Alta resistencia, estabilidad y disponibilidad son los parámetros más importantes de los materiales inorgánicos, especialmente de los óxidos seleccionados (SiO2, ZnO, ZrO2, MgO, etc.)23. Además, se pueden sintetizar mediante métodos sencillos y rápidos, lo que los hace relativamente baratos. También cabe señalar que se pueden introducir biopolímeros en la superficie de los óxidos metálicos para aumentar su afinidad por las enzimas7,24. Existe mucha información en la literatura sobre materiales a base de quitosano/quitina/celulosa y óxidos inorgánicos, y su aplicación en la inmovilización enzimática25,26,27,28.

Los polisacáridos de origen natural desempeñan un papel importante en las industrias farmacéutica y cosmética. Se obtienen ampliamente a partir de algas, incluidas las algas pardas29,30. Las algas pardas (Phaeophyta) son un grupo de algas con un grado muy alto de especialización en la estructura del talo, que con mayor frecuencia tiene la forma de un hilo ramificado31,32,33. Las algas son una fuente de polisacáridos potencialmente bioactivos, entre los cuales el fucoidan extraído de algas pardas (especialmente de especies de Fucus y tejidos de equinodermos) es actualmente el compuesto que se está estudiando más extensamente34,35. El fucoidan se puede obtener de diversas fuentes marinas, incluidos los pepinos de mar36 y las algas pardas37. Se ha establecido un alto contenido de fucoidán en un gran número de algas e invertebrados, por ejemplo, Fucus vesiculosus, Sargassum stenophyllum, Chorda filum, Ascophyllum nodosum, Dictyota menstrualis, Fucus evanescens, Fucus serratus, Fucus distichus, Caulerpa racemosa, Hizikia fusiforme, Padina. gymnospora, Kjellmaniella crassifolia, Analipus japonicus y Laminaria hyperborea. En estas fuentes están presentes diferentes tipos de fucoidan y para su obtención se utilizan diversos métodos de extracción38.

Fucoidan consta de moléculas de α-l-fucopiranosa, que pueden estar conectadas mediante enlaces 1→3 o alternando enlaces 1→3 y 1→4. Para obtener la estructura ramificada en la cadena principal, se unen radicales de α-l-fucopiranosa, así como radicales de sulfato(VI) inorgánicos y radicales orgánicos como el d-glucurónico y el acetilo. Varias de las estructuras de fucoidan también contienen pequeñas cantidades de otros monosacáridos, por ejemplo, glucosa, galactosa, xilosa y/o manosa39,40,41,42. Fucoidan ofrece una variedad de propiedades biológicas, incluidas propiedades antibacterianas, antioxidantes, antivirales, antiinflamatorias, anticoagulantes y anticancerígenas43,44,45. Además, el fucoidan es biocompatible, biodegradable y no tóxico46,47.

Debido a sus características únicas, el fucoidan es un biopolímero prometedor que también puede utilizarse como material de recubrimiento. Hasta la fecha, los materiales modificados con fucoidan se han utilizado en aplicaciones médicas como la administración de fármacos48,49,50,51,52. El sistema magnético de sílice mesoporosa fue modificado con fucoidan por Moorthy et al.48. Se aplicó fucoidan a la superficie de sílice mediante una técnica de coordinación de complejo metal-ligando. El material propuesto se utilizó como portador de fármacos y como agente de hipertermia para aplicaciones de quimioterapia y terapia térmica basada en hipertermia magnética en terapias emergentes contra el cáncer. En otros estudios, se recubrieron nanopartículas de CuS con fucoidan y se aplicaron en terapia quimiofototérmica contra células cancerosas49. En este caso, se introdujo fucoidan sobre la superficie de CuS mediante una técnica capa por capa utilizando compuestos policatiónicos y aniónicos. En otro estudio, Shin et al.50 desarrollaron nanopartículas de dióxido de manganeso recubiertas de fucoidan (Fuco-MnO2-NP) y las probaron en el tratamiento clínico del cáncer. Las MnO2-NP se recubrieron con fucoidan mediante el método de adsorción. Venkatesan et al.51 utilizaron un complejo fucoidan-quitosano para modificar nanopartículas de plata (AgNP). Este sistema tiene un alto potencial para aplicaciones alimentarias y cosméticas. Otro equipo de investigación diseñó nanopartículas bimodales de óxido de zinc/óxido de hierro recubiertas de fucoidan para aplicaciones médicas52.

Hasta ahora no se han investigado materiales inorgánicos modificados con fucoidan como soportes para la inmovilización enzimática. Por lo tanto, en este estudio, se modificaron compuestos inorgánicos seleccionados de MxOy (ZrO2 y MgO) con fucoidan (Fuc). Un objetivo clave fue confirmar la modificación de MxOy con fucoidan mediante una variedad de análisis espectroscópicos: espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS). Además, se realizó análisis termogravimétrico (TG/DTG). Los materiales MxOy/Fuc preparados se usaron luego como soportes para la lipasa. Se analizaron la cantidad de lipasa inmovilizada, la actividad catalítica y las imágenes microscópicas confocales para confirmar el éxito de la inmovilización.

En el estudio se utilizaron los siguientes materiales: isopropóxido de circonio (TPZ), solución de amoníaco al 25% (NH3aq.), alcohol etílico (EtOH), óxido de magnesio en polvo, fucoidan de Fucus vesiculosus (Fuc), lipasa de Aspergillus niger (LAN), fosfato de sodio (NaH2PO4), fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4), palmitato de p-nitrofenilo (p-NPP), p-nitrofenol (p-NP), 2-propanol, Triton X-100 y goma arábiga. Todos estos materiales se compraron en Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EE. UU.).

El polvo de óxido de magnesio de alta pureza (98%) utilizado en estos estudios se adquirió de Sigma-Aldrich. El ZrO2 se sintetizó mediante el método sol-gel. En este caso, se dosificaron isopropóxido de circonio y amonio en un reactor que contenía etanol. La mezcla se agitó durante 1 h. El siguiente paso de la síntesis fue la cristalización (envejecimiento; 24 h). El óxido de circonio (ZrO2) resultante se lavó con agua, se filtró y luego se secó a 105 °C.

En la siguiente etapa de la investigación, se modificaron ZrO2 y MgO con fucoidan. Para ello se preparó la solución acuosa de fucoidan (1 mg/mL), se añadió 1 g del óxido apropiado a la solución de fucoidan (10 mL) y se agitó magnéticamente durante 24 h. El sistema híbrido MxOy/Fuc resultante se filtró y se secó a 60 °C. Las muestras obtenidas se marcaron como ZrO2/Fuc y MgO/Fuc.

Para confirmar tanto la funcionalización de ZrO2 y MgO con fucoidan como el proceso de inmovilización, se realizaron análisis espectroscópicos: espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), resonancia magnética nuclear (RMN 1H y 13C) y espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS). En los materiales complementarios se proporciona una descripción detallada de estos análisis.

El análisis termogravimétrico (TG/DTG) se realizó utilizando un analizador termogravimétrico Jupiter STA 449F3 (Netzsch, Alemania). Las mediciones se llevaron a cabo bajo un flujo de nitrógeno a una velocidad de calentamiento de 5 °C/min y en un rango de temperatura de 30 a 1000 °C, con un peso de muestra inicial de aproximadamente 5 mg.

Se utilizaron ZrO2/Fuc y MgO/Fuc como soportes para la inmovilización de lipasa. El proceso se realizó mediante un método de adsorción. Se agitó una cantidad específica de matriz con la solución de lipasa (5 mg/ml, tampón fosfato a pH = 7) en una incubadora (20 °C, IKA-Werke, Staufen, Alemania) durante 24 h. Luego, el sistema biocatalítico preparado (ZrO2/Fuc/LAN o MgO/Fuc/LAN) se separó mediante filtración. Se utilizó el análisis de Bradford53 para confirmar el resultado del proceso de inmovilización y calcular la cantidad de lipasa inmovilizada (PLAN, mgenzima/gsoporte) y el rendimiento de la inmovilización (PI,%). En el siguiente paso se evaluó la actividad enzimática de la lipasa inmovilizada. El modelo de reacción utilizado fue la transformación de p-NPP (palmitato de p-nitrofenilo) en p-NP (p-nitrofenol). La liberación del producto se observó a 410 nm (usando un espectrofotómetro JASCO V650, Japón). Todas las reacciones (realizadas por triplicado) se llevaron a cabo con agitación a 1000 rpm durante 2 min a 30 °C. Con base en los resultados, se estimaron las actividades aparente (U/gcatalizador), específica (U/mgenzima) y relativa (%). Las ecuaciones utilizadas para calcular la actividad se proporcionan en los Materiales complementarios. Los parámetros cinéticos, incluida la constante de Michaelis-Menten (KM) y la velocidad máxima de reacción (Vmax), se determinaron mediante un ensayo enzimático basado en la misma reacción mencionada anteriormente, utilizando varias concentraciones de la solución de sustrato (0,005–1,5 M). Los parámetros cinéticos aparentes de la enzima libre e inmovilizada se calcularon basándose en el gráfico de Hanes-Woolf. La eficiencia de la inmovilización también fue confirmada indirectamente mediante análisis FTIR y XPS.

La morfología de los híbridos MxOy/Fuc y la lipasa inmovilizada se evaluó sobre la base de fotografías de microscopía de barrido láser confocal (CLSM) (LSM710, Zeiss, Alemania), obtenidas utilizando un láser de argón (488 nm). En modo material (luz reflejada), el láser operaba a una longitud de onda de 458 nm. En el modo de fluorescencia, el láser funcionó a 488 nm y se observó fluorescencia en el rango de 510 a 797 nm.

El análisis espectroscópico se emplea para explorar materiales híbridos, proporcionando información práctica como el tipo elemental, la composición química, las propiedades ópticas y electrónicas y la cristalinidad. En este estudio, se utilizaron análisis espectroscópicos para confirmar la funcionalización de ZrO2 y MgO con fucoidan. Los grupos característicos en la estructura del fucoidan se interpretaron con precisión basándose en el espectro FTIR (Fig. 1). Se identificaron las siguientes bandas: grupo OH del monómero monosacárido (a 3500 cm-1); alifático C – H (a 2983 y 2945 cm-1); Vibraciones de estiramiento O – C – O (a 1635 cm −1); vibraciones de estiramiento asimétricas de S=O en el grupo sulfato (a 1258 cm-1); enlace éter C – O (a 1070 cm-1); C – O – S (a 846 cm −1); y una banda característica para azúcares desoxi como la fucosa (a 572 cm-1). Además, una señal a 846 cm-1 corresponde a la sulfatación en la posición ecuatorial, donde el éster de sulfato se une al C-2 de la fucosa para formar sulfato de fucosa54,55.

Espectros FTIR de fucoidan, MgO/Fuc y ZrO2/Fuc.

Los espectros FTIR de MgO y ZrO2 modificados con fucoidan se presentan en la Fig. 1. Confirman que el óxido metálico se funcionalizó con éxito con fucoidan. Los grupos característicos de óxido puro (Fig. 1S) y fucoidan aparecen en los espectros FTIR de MgO/Fuc y ZrO2/Fuc. En el espectro FTIR de MgO/Fuc (Fig. 1) están presentes los siguientes grupos fucoidan: OH (a 3450 cm-1); C=O (a 1650 cm-1); S=O (a 1450 cm-1); C – O (a 1150 cm-1). La banda pequeña para los grupos C – O y la banda pequeña y ancha para los grupos OH indican la conexión directa del fucoidan con la superficie del MgO.

El espectro FTIR para ZrO2/Fuc contiene bandas para OH (a 3450 cm-1); C – H (a 2900 cm-1); S=O (1400 cm-1); y C – O – S (a 800 cm −1) (Fig. 1). La banda ancha e intensa con un máximo a 3500 cm-1 indica la conexión de fucoidan con ZrO2 a través de enlaces de hidrógeno de moléculas de agua. Esto se evidencia además por el cambio en esta banda con respecto a la banda obtenida para fucoidan puro. El pico estrecho y débil a 3700 cm-1 puede originarse en agua pura, que puede adherirse a la superficie modificada con fucoidan de ZrO2 durante el proceso de funcionalización de fucoidan en solución acuosa.

También se utilizó espectroscopía XPS para confirmar la funcionalización de MgO y ZrO2 con fucoidan. Los resultados se muestran en la Fig. 2. En la superficie de MgO y ZrO2 (Fig. 2S), están presentes elementos como magnesio, circonio y oxígeno. Los híbridos MgO/Fuc y ZrO2/Fuc contienen los mismos elementos, pero también están presentes carbono y azufre, lo cual es consecuencia de la modificación con fucoidan (Fig. 2a).

Espectros de estudio XPS de MgO/Fuc y ZrO2/Fuc (a), y el XPS desconvolucionado de C 1 para MgO/Fuc; S2p para MgO/Fuc; C1s para ZrO2/Fuc; y S 2p para ZrO2/Fuc (b).

Un análisis detallado de las líneas C 1s y S 2p del espectro XPS proporciona información adicional sobre la interacción del fucoidan con la superficie del óxido inorgánico. Las líneas XPS C 1s y S 2p de los híbridos MgO/Fuc y ZrO2/Fuc se muestran en la Fig. 2b. Los átomos de carbono y azufre no están presentes en la superficie de MgO y ZrO2 (Fig. 2S). En la línea XPS C 1s para MgO/Fuc, los dos picos C1s se identificaron alrededor de 288,7 eV y 286,2 eV, correspondientes respectivamente a los enlaces O – C – O y C – OH / C – O. Aquí, los enlaces C-OH/C-O están más expandidos. Una situación diferente se observa con la línea C 1s para ZrO2/Fuc. En este caso, los dos picos de C 1 también se reconocen alrededor de 290,8 eV (O – C – O) y 289,4 eV (C – OH / C – O). Sin embargo, el tamaño de estos picos es similar. La deconvolución del pico espectral de fucoidan S 2p muestra dos ambientes químicos de azufre a aproximadamente 167,0 eV (para el grupo –SO3–) y 170,9 eV (para el grupo –OSO3– que interactúa)56,57,58. Para MgO / Fuc y ZrO2 / Fuc, solo se observó un entorno de azufre, con energías de enlace de 170,7 eV (grupo –OSO3– interactuante) y 168,8 eV (grupo –SO3–) respectivamente (Fig. 2b). El cambio en el pico de energía de unión puede indicar interacciones de algunos grupos sulfato de fucoidan con la superficie del óxido metálico58.

Los espectros de 1H y 13C del fucoidan puro (Fig. 3) nos proporcionan información sobre la estructura del polisacárido puro y el patrón de enlaces de hidrógeno característico del material utilizado, y sirven como referencia para el análisis de los datos obtenidos para el material investigado. muestras. Además, dado que las muestras se obtuvieron mediante síntesis húmeda, se esperaba encontrar una señal de moléculas de agua residuales en los espectros 1H de las matrices funcionalizadas. Se utilizaron espectros de 13C para confirmar que las moléculas de fucoidan estaban presentes en las matrices. Las diferencias en los espectros de 13C entre la muestra de fucoidan puro y la funcionalizada indicarán un cambio en la estructura de la cadena de polisacárido causado por la interacción con la superficie de la matriz. Como las moléculas de fucoidan pueden formar enlaces de hidrógeno, el cambio en los espectros 1H indicaría un mecanismo de funcionalización de la superficie de las matrices con moléculas de fucoidan, basado en la creación de enlaces de hidrógeno entre la superficie de la matriz y las moléculas de fucoidan.

Espectro de RMN DP/MAS SE 1H en estado sólido (a) y espectro de RMN CP/MAS 13C (b) de fucoidan a temperatura ambiente. Espectros de RMN DP/MAS 1H en estado sólido para MgO/Fuc (c) y ZrO2/Fuc (d) a temperatura ambiente; y espectros de RMN CP/MAS 13C en estado sólido para MgO/Fuc (e) y ZrO2/Fuc (f) a temperatura ambiente.

El espectro 1H (Fig. 3a) muestra una señal intensa en la región de 5,5 a 4,25 ppm, que proviene de protones del anillo unidos a carbonos C2 a C5, grupos OH de fucoidan y moléculas de agua residuales. Las pequeñas señales de 2 a 1,5 ppm se originan en grupos metilo ubicados en los carbonos C6. El espectro de 13C (Fig. 3b) muestra una señal fuerte a 16,8 ppm identificada como carbonos C6 en grupos metilo, mientras que la señal amplia a 85-60 ppm proviene de los carbonos del anillo C2-C5, y la señal a 100 ppm de los carbonos C1.

La Figura 3c-f muestra los espectros de 1H y 13C registrados para matrices funcionalizadas con moléculas de fucoidan. En el espectro ZrO2 / Fuc 1H se observa una fuerte señal de OH del fucoidan y el agua residual (Fig. 3c). El cambio observado en el desplazamiento químico de la señal más intensa en el rango de 5,5 a 4,25 ppm está relacionado con los grupos OH en el fucoidan y el agua residual, lo que indica que la estructura de los enlaces de hidrógeno presentes en las muestras cambia. En el caso del ZrO2 (fig. 3c) se puede observar una división de la señal en el rango de 7,5 a 3,5 ppm. Esta división es causada por grupos OH involucrados en la creación de enlaces de hidrógeno entre las moléculas de fucoidan y la superficie de la matriz de ZrO2. El pico se desplaza hacia campos inferiores en 1,4 ppm, lo que indica la creación de fuertes enlaces de hidrógeno. El segundo pico que aparece a 4,3 ppm corresponde muy bien a las señales de protones de la unidad del anillo de la molécula de fucoidan. Junto con la falta de cambio en la posición de la señal a 2-1,5 ppm, esto implica que los mecanismos de funcionalización de la matriz de ZrO2 con fucoidan se deben a la creación de enlaces de hidrógeno. La matriz de MgO utilizada se adquirió comercialmente y se utilizó sin preparación adicional para el procedimiento de funcionalización. Los espectros de protones de esta matriz funcionalizada con fucoidan se muestran en la Fig. 3e. Sólo se detectaron pequeñas señales de las moléculas de fucoidan, sin picos de moléculas de agua residuales. Los cambios químicos observados corresponden a los de las moléculas de fucoidan encontradas en la literatura y no se detectó ningún cambio en la señal del grupo hidroxilo.

Los espectros de 13C proporcionan evidencia directa de la presencia de moléculas de fucoidan en las matrices estudiadas. Los espectros de 13C de las muestras estudiadas se muestran en la Fig. 3e, f. Sólo la matriz de ZrO2 funcionalizada con fucoidan muestra señales bien detectables de las unidades de fucoidan; en el caso de matrices de MgO sólo se detectaron señales muy débiles de carbonos aromáticos. Comparando los espectros de 1H y 13C de las muestras estudiadas podemos sacar conclusiones sobre la composición química de las muestras. Se descubrió que la matriz de MgO adquirida comercialmente estaba libre de impurezas después de los procesos de síntesis, pero solo se encontró una cantidad muy pequeña de moléculas de fucoidan en la matriz funcionalizada. Las débiles señales de 1H de las moléculas de fucoidan indican una cantidad muy pequeña de esta sustancia, lo que también se confirma por las señales casi indetectables de 13C de la unidad de fucosa. Otro hallazgo importante es que también faltan las señales de las moléculas de agua residuales que se espera que queden después del proceso de funcionalización.

Sobre la base de los análisis espectroscópicos se puede concluir que la funcionalización de materiales de óxido con moléculas de fucoidan fue exitosa. Sin embargo, el análisis de RMN muestra que se logró un mejor efecto con ZrO2. Se demostró que las moléculas de fucoidan se unen a la superficie de la matriz de ZrO2 mediante enlaces de hidrógeno; las moléculas pueden unirse directamente o mediante moléculas de agua residuales. Además, tras la funcionalización del MgO sólo se encontró una pequeña cantidad de unidades de fucoidan. Además, es importante señalar que en esta muestra no se detectó ninguna señal de los grupos hidroxilo de las moléculas de agua. Por lo tanto, se puede concluir que el agua juega un papel importante en el procedimiento de funcionalización y media en la unión de las moléculas de fucoidan a la superficie de la matriz. Además, los análisis FTIR y XPS confirman la modificación positiva con fucoidan, donde se observan los enlaces/picos característicos del fucoidan.

La Figura 4 muestra las curvas TG/DTG de fucoidan y los híbridos MgO/Fuc y ZrO2/Fuc. El termograma de fucoidan (Fig. 4a) presenta cuatro pasos de pérdida de masa. La primera pérdida de masa (pico exotérmico I) del 6% a 100 °C corresponde a agua físicamente adsorbida. El segundo y tercero, a 240 °C (aproximadamente 22%, pico exotérmico II) y 355 °C (42%, pico exotérmico III) están asociados con la pérdida de grupos sulfato. La pérdida de masa final, de aprox. El 70%, que ocurre a 800 °C (pico exotérmico IV), probablemente esté relacionado con la descomposición de residuos de carbono48,59. Además, se observan cambios entre las curvas TG/DTG de óxido inorgánico puro (Fig. 6S) y la muestra después de la funcionalización con fucoidan (Fig. 4b, c). La muestra de MgO/Fuc mostró una pérdida de masa total del 5%. La pérdida de masa se produjo en tres etapas, con pérdidas importantes en la segunda etapa (aprox. 4% a 380 °C) y en la tercera (5% a 650 °C), probablemente correspondientes a la descomposición colectiva del revestimiento de la superficie. unidades poliméricas de fucoidan59. También se observa un cambio en la pérdida de masa total en las curvas TG/DTG de ZrO2 (Fig. 8S) y ZrO2/Fuc (Fig. 4c). En este caso, el híbrido ZrO2/Fuc pierde aproximadamente el 20% de su masa total. Aquí sólo se observan dos picos exotérmicos (a 100 y 220 °C), asociados con agua adsorbida física y químicamente. La naturaleza de la pérdida de masa y el pico faltante por encima de 600 °C sugieren que las moléculas de fucoidan se evaporaron del sistema antes de que ocurriera la descomposición de los residuos de carbono. Esto se puede entender si las moléculas de fucoidan estuvieran unidas a la superficie de ZrO2 a través de moléculas de agua.

Curvas TG/DTG de fucoidan (a); MgO/Fuc (b); y ZrO2/Fuc (c).

Sin embargo, los cambios en la pérdida de masa total de ambas muestras después de la modificación con fucoidan (MgO/Fuc y ZrO2/Fuc) sugieren que fucoidan se incorporó con éxito en la superficie de MgO y ZrO2.

Los materiales híbridos MgO/Fuc y ZrO2/Fuc diseñados se utilizaron como soportes para la inmovilización de lipasa. El efecto del pH sobre la inmovilización de la lipasa se investigó como se muestra en la Fig. 5. El rendimiento de la inmovilización de la lipasa sobre MgO/Fuc aumentó del 65 % a pH 4 al valor más alto de 88,4 % a pH 7,0, pero disminuyó al 66,2 % a pH 9. El rendimiento de inmovilización de la lipasa sobre ZrO2/Fuc mostró una tendencia similar, que fue del 34,8% a pH 4, alcanzando el valor más alto del 78,2% a pH 8, y disminuyó al 45% a pH 9. Los protones se unen al par solitario. electrones en el átomo amino N en condiciones ácidas. Mientras que a pH 8, los enlaces de hidrógeno del soporte se romperán en condiciones de alcalinidad4,5. Con base en la información, se determinó que el pH óptimo para la inmovilización era 7,0.

Efecto del pH sobre la inmovilización de lipasa de Aspergillus niger sobre MgO/Fuc y ZrO2/Fuc.

En la Tabla 1S se proporciona información básica sobre la eficiencia de la inmovilización de enzimas y la actividad catalítica de la lipasa inmovilizada en MgO/Fuc y ZrO2/Fuc. Los resultados de los parámetros catalíticos indican que los materiales propuestos en este estudio (tanto MgO/Fuc como ZrO2/Fuc) pueden usarse como soportes para la enzima. La cantidad de lipasa inmovilizada fue de 91,8 mg en 1 g de MgO/Fuc y de 70,8 mg en 1 g de ZrO2/Fuc. Las eficiencias de inmovilización fueron del 61,2% y 78,6%, respectivamente. Los sistemas biocatalíticos obtenidos (MgO/Fuc/LAN y ZrO2/Fuc/LAN) exhibieron actividades catalíticas similares. La lipasa inmovilizada en MgO/Fuc tuvo actividades aparentes y específicas de 145,5 U/g de catalizador y 1,58 U/mgenzima, mientras que los valores correspondientes para el sistema biocatalítico ZrO2/Fuc/LAN fueron AAp = 144,0 U/g de catalizador y AS = 2,03 U/mgenzima.

Se evaluó la influencia de la temperatura y la reutilización durante varios ciclos sobre la actividad enzimática de la lipasa inmovilizada (Fig. 6). Los resultados muestran que la lipasa inmovilizada tanto en MgO/Fuc como en ZrO2/Fuc retuvo más del 40% de su actividad a temperaturas en el rango de 20 a 70 °C (Fig. 6a). En ambos casos (MgO/Fuc/LAN y ZrO2/Fuc/LAN) la actividad máxima se logró a 50 °C, lo que indica que la lipasa inmovilizada sobre los materiales propuestos puede usarse en condiciones más duras. Además, la enzima inmovilizada tiene una forma heterogénea y puede usarse durante varios ciclos de reacción enzimática. Las pruebas mostraron que los sistemas biocatalíticos propuestos (MgO/Fuc/LAN y ZrO2/Fuc/LAN) retuvieron ca. 40% de su actividad inicial después de 12 ciclos (Fig. 6b).

Influencia de la temperatura (a) y el uso repetido sobre la actividad catalítica de la lipasa libre e inmovilizada (b).

Además, se determinaron los parámetros cinéticos como la constante de Michaelis-Menten (KM) y la velocidad máxima de reacción (Vmax). Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1. Un valor de KM más bajo después de la inmovilización indica una mayor capacidad de unión con respecto al sustrato. Mientras que una Vmax más alta sugiere que la lipasa inmovilizada puede catalizar la reacción más rápido que la lipasa libre.

La quitina, el quitosano y la celulosa son los polisacáridos más utilizados para modificar los óxidos inorgánicos. En la Tabla 2 se muestra una comparación de los resultados obtenidos en este estudio con resultados previos sobre la inmovilización de lipasa en varios híbridos a base de polisacáridos. Los resultados muestran que los materiales a base de polisacáridos y óxidos inorgánicos se pueden aplicar con éxito como soportes para la inmovilización de lipasa ( de diversos orígenes). Se inmovilizaron diferentes tipos de lipasas (de Candida rugosa, páncreas porcino, Aspergillus niger y Rhizomucor miehei) sobre las siguientes matrices: quitina/óxido de grafeno, quitosano/sílice mesoporosa, nanopartículas magnéticas recubiertas de quitosano y celulosa/Fe2O360,61,62. 63. Las lipasas inmovilizadas exhibieron actividad enzimática en el rango de 125 a 328 U/g y pudieron usarse durante varios ciclos de reacción (de 5 a 14), conservando entre el 50 y el 90% de su actividad inicial. Los resultados obtenidos en el presente estudio son similares a otros; La diferencia observada probablemente se debe al uso de diferentes tipos de lipasas, que exhiben diferentes actividades enzimáticas en su forma nativa.

El éxito del proceso de inmovilización también fue confirmado indirectamente por los resultados del análisis FTIR y XPS, que se presentan como espectros en la Fig. 6.

Con base en los espectros FTIR (Fig. 7a), se concluye que la mayoría de los grupos característicos de la lipasa también se observan en la superficie del sistema biocatalítico propuesto. Las siguientes señales principales están presentes en el espectro FTIR de la lipasa: vibraciones de estiramiento de los enlaces N-H en 3220 cm-1, bandas amida I, II y III (de 1650 a 1410 cm-1) y estiramiento de C-O. enlaces a 1080 cm-1. Los cambios observados entre los espectros FTIR del soporte puro (Fig. 1) y el sistema con lipasa inmovilizada confirman el éxito del proceso de inmovilización. En el espectro FTIR de MgO/Fuc/LAN, los mayores cambios se observan en las bandas amida III y –C–O, mientras que el espectro ZrO2/Fuc/LAN exhibe cambios en las bandas N–H y C–O.

Espectros FTIR de lipasa, MgO/Fuc/LAN y ZrO2/Fuc/LAN (a). Espectros de encuesta XPS (b) y deconvolución de la línea N 1s (c) para lipasa nativa, MgO/Fuc/LAN y ZrO2/Fuc/LAN.

El espectro XPS de la lipasa libre (Fig. 7b) contiene tres picos característicos con energías de unión de 531,0 eV, 400,7 eV y 287,7 eV, que están relacionados con O 1, N 1 y C 1. Los mismos picos se observan en los espectros de estudio de MgO/Fuc/LAN y ZrO2/Fuc/LAN, lo que confirma la presencia de lipasa en la superficie del material híbrido. Lo más importante es la presencia de picos N 1s (Fig. 7c; no observados en el soporte puro; ver Fig. 2), que pueden atribuirse a los grupos CO – NH – y amino de la lipasa, y proporcionan evidencia adicional de la inmovilización. de lipasa sobre el óxido funcionalizado con fucoidan59. Además, los cambios en las líneas de deconvolución de C 1s también confirman la inmovilización de la lipasa (ver Fig. 5S).

Además, se encontró que MgO/Fuc y ZrO2/Fuc exhibieron una mayor intensidad de fluorescencia después de la inmovilización de lipasa, lo que confirma indirectamente la presencia de biomoléculas enzimáticas en los materiales híbridos (Fig. 8). Las imágenes microscópicas de MgO/Fuc y MgO/Fuc/LAN muestran una estructura homogénea en ambos modos (Fig. 8a). Las imágenes de ZrO2/Fuc (Fig. 8b) revelan una pequeña cantidad de puntos brillantes, mientras que el sistema biocatalítico ZrO2/Fuc/LAN emite más luz.

Imágenes de microscopía confocal de MgO/Fuc y MgO/Fuc/LAN (a); ZrO2/Fuc y ZrO2/Fuc/LAN (b) en modo de reflexión y fluorescencia.

En resumen, los resultados obtenidos confirman que la funcionalización de MxOy con fucoidan, y la posterior inmovilización de la lipasa, se llevaron a cabo con éxito. Basado en el análisis espectroscópico, se propuso un mecanismo de interacción entre los materiales óxidos, fucoidan y la enzima (Fig. 9). Como se muestra, el fucoidan se adhiere directamente a la superficie del MgO y se forman enlaces de hidrógeno, mientras que los enlaces de hidrógeno entre el fucoidan y el ZrO2 se generan a través de moléculas de agua. Entre el soporte y la enzima sólo existen interacciones electrostáticas.

Mecanismo de interacción propuesto entre el soporte óxido: MgO (a) y ZrO2 (b), fucoidan y lipasa.

En este estudio, se fabricaron y aplicaron nuevos híbridos a base de polisacáridos en la inmovilización de lipasa. Los materiales híbridos propuestos se prepararon funcionalizando óxidos de magnesio (MgO) y circonio (ZrO2) con fucoidan de Fucus vesiculosus. Los análisis fisicoquímicos confirmaron la modificación efectiva del óxido de magnesio y del circonio con fucoidan de Fucus vesiculosus. Las pruebas de propiedades catalíticas mostraron que los híbridos MxOy/híbridos fabricados pueden usarse como soportes para la lipasa de la inmovilización de Aspergillus niger. Se logró una actividad enzimática mejorada (aproximadamente 145 U/g) y los sistemas biocatalíticos obtenidos se pueden utilizar durante varios ciclos enzimáticos, conservando un alto porcentaje de su actividad inicial. Los parámetros cinéticos muestran que la lipasa inmovilizada puede catalizar la reacción enzimática más rápidamente que su forma libre. Los resultados obtenidos en estos experimentos muestran que los híbridos basados ​​en fucoidan y óxido inorgánico pueden utilizarse con éxito en la inmovilización de enzimas.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24515-9

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Esta investigación fue financiada por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia (2020/04/X/ST5/00318) y el Ministerio de Educación y Ciencia de Polonia (0912/SBAD/2206).

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Andrzej Biadasz

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Conceptualización; Curación de datos; análisis formal; metodología; roles/escritura—borrador original—AK-R.; Análisis formal; redacción—revisión y edición—MB; Análisis formal—AB, supervisión; redacción—revisión y edición—TJ Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Agnieszka Kołodziejczak-Radzimska.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Kołodziejczak-Radzimska, A., Bielejewski, M., Biadasz, A. et al. Evaluación del sistema híbrido MxOy/fucoidan y su aplicación en el proceso de inmovilización de lipasa. Representante científico 12, 7218 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11319-0

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Recibido: 21 de febrero de 2022

Aceptado: 21 de abril de 2022

Publicado: 04 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11319-0

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