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Jun 21, 2023

La proteína Vertex PduN sintoniza el rendimiento de la vía encapsulada al dictar la morfología del metabolosoma bacteriano

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3746 (2022) Cite este artículo 2584 Accesos 5 Citas 9 Detalles de Altmetric Metrics La ingeniería de la organización subcelular en microbios muestra una gran

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 3746 (2022) Citar este artículo

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La ingeniería de la organización subcelular en microbios es muy prometedora para abordar los obstáculos en los esfuerzos de ingeniería metabólica; sin embargo, faltan reglas que guíen la selección de una estrategia o plataforma organizacional. Aquí, estudiamos la morfología del compartimento como un factor que media el rendimiento de la vía encapsulada. Utilizando el sistema de microcompartimento de utilización de 1,2-propanodiol (Pdu MCP) de Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2, encontramos que podemos cambiar la morfología de este nanorreactor de proteínas de poliédrico a tubular eliminando la proteína de vértice PduN. El análisis de la función metabólica entre estos microtubos Pdu (MT) muestra que proporcionan una barrera de difusión capaz de proteger el citosol de una vía tóxica intermedia, similar a las MCP nativas. Sin embargo, el modelado cinético sugiere que las diferentes proporciones de superficie a volumen de las estructuras MCP y MT alteran el rendimiento de la vía encapsulada. Finalmente, informamos un ensayo basado en microscopía que permite una evaluación rápida de la formación de Pdu MT para permitir futuros esfuerzos de ingeniería en estas estructuras.

La organización espacial de los procesos biológicos es esencial para la vida en muchos organismos, desde eucariotas multicelulares hasta procariotas unicelulares. Una vez que se pensaba que carecían de organización subcelular, las bacterias utilizan una variedad de estrategias para segregar procesos específicos dentro de la célula. Un ejemplo de ello son los microcompartimentos bacterianos (MCP), que son orgánulos que encierran conjuntos específicos de enzimas en una capa de proteína1,2. Los genes asociados con las MCP se encuentran en 45 filos bacterianos3,4 y se clasifican según los segmentos de la vía metabólica que encapsulan. En el nivel más alto, las MCP se clasifican como carboxisomas o metabolosomas según si encierran vías involucradas en procesos anabólicos o catabólicos, respectivamente1. Los carboxisomas ayudan a muchas bacterias fijadoras de carbono al aumentar la concentración de CO2 en las proximidades de la enzima carboxilante ribulosa bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO)5,6. Los metabolosomas, por otro lado, ayudan en el metabolismo de una amplia gama de sustratos y, por lo tanto, encapsulan muchas vías químicas diferentes; sin embargo, estas vías suelen compartir una característica unificadora: pasar a través de un intermediario aldehído tóxico7,8. Se cree que el secuestro de este intermediario tóxico ayuda en el metabolismo de fuentes de carbono de nicho como el 1,2-propanodiol y la etanolamina, proporcionando una ventaja de crecimiento competitivo para los patógenos entéricos que a menudo albergan metabolosomas9,10.

Las MCP representan objetivos de ingeniería atractivos en una variedad de aplicaciones, desde la bioproducción, donde la encapsulación de enzimas heterólogas podría mejorar el rendimiento de la vía11, hasta el desarrollo de antibióticos, donde la alteración de estas estructuras de MCP podría eliminar una ventaja de crecimiento competitivo9. Sin embargo, los metabolosomas en particular exhiben diversidad en forma y tamaño, y no se comprende bien cómo estas características se relacionan con la función4,12,13,14,15. Diversos campos de la ingeniería, desde la catálisis16 hasta la administración de fármacos17, han ilustrado la importancia de la forma y el tamaño en el rendimiento de los nanomateriales. La relevancia de estas características aún no se ha investigado de manera significativa en los sistemas MCP.

El MCP de utilización de 1,2-propanodiol (Pdu) es un metabolosoma modelo que ayuda en la descomposición del 1,2-propanodiol18. Las Pdu MCP existen en una variedad de bacterias3,4,10, y se han investigado tanto la vía encapsulada10,18,19 como la estructura20 de estos metabolosomas. El operón pdu contiene 21 genes que codifican las proteínas que forman la cubierta de Pdu MCP, así como la vía principal y las enzimas de reciclaje de cofactores (Fig. 1). Ocho proteínas componen la cubierta del microcompartimento de Pdu (MCP): PduA, PduB, PduB', PduJ, PduK, PduN, PduT y PduU21,22. De estas ocho proteínas, siete (PduABB'JKTU) contienen uno o más dominios pfam00936 del microcompartimento bacteriano (BMC) y, como tales, forman los multímeros hexagonales que se ensamblan en las facetas y bordes del microcompartimento22,23,24,25,26. ,27. pduN es el único gen pfam03319 del vértice del microcompartimento bacteriano (BMV) en el operón pdu y, por lo tanto, se espera que forme pentámeros que cubren los vértices del Pdu MCP15,28,29,30,31,32. PduN es un componente de baja abundancia de la capa de MCP, pero es esencial para la formación de estructuras compartimentales bien formadas21,22,33. Si bien estudios anteriores han ilustrado que se forman estructuras aberrantes en ausencia de PduN, la funcionalidad y naturaleza de estas estructuras aún no se han explorado en detalle. Además, los estudios sobre carboxisomas alfa y beta demostraron que se requiere un cierre estricto de la cubierta para que estos microcompartimentos confieran sus beneficios de crecimiento biológicamente relevantes y que esto no se puede lograr en ausencia de proteínas de la cubierta del vértice pentamérica como PduN34,35. No está claro qué tan importante es este cierre estricto para sistemas de metabolosomas como el Pdu MCP, ya que los estudios de modelado han demostrado que una barrera de difusión moderada entre el citosol y un núcleo enzimático es suficiente para mediar la acumulación de intermediarios tóxicos36. Trabajos anteriores han sugerido la diferente importancia de varias proteínas de la cubierta, incluida PduN, en la función de Pdu MCP22; pero quedan dudas sobre cómo precisamente la morfología de MCP controla el rendimiento de la vía de Pdu.

El operón pdu en Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 contiene los genes que codifican las proteínas responsables de la formación del microcompartimento de utilización de 1,2-propanodiol (Pdu MCP). Estos incluyen enzimas que realizan pasos clave de la ruta y funciones de reciclaje de cofactores (naranja) y proteínas de cubierta que encierran estas enzimas (microcompartimento bacteriano, BMC, genes que contienen dominios se muestran en azul, vértice del microcompartimento bacteriano, BMV, gen que contiene dominios se muestra en verde ). En particular, sólo una proteína de la cubierta del operón pdu, PduN, contiene un dominio BMV.

Aquí, describimos nuestra caracterización detallada de una estructura relacionada con MCP que llamamos microtubos Pdu (Pdu MT) que se forman cuando la proteína de vértice PduN no puede incorporarse a la cubierta de Pdu MCP, y utilizamos modelos de dinámica molecular para comprender las interacciones moleculares responsables de esta morfología. cambio. Investigamos cómo este cambio en la morfología afecta el rendimiento de la vía encapsulada y utilizamos modelos cinéticos para interrogar qué características de la geometría del compartimento controlan la acumulación de intermediarios tóxicos en la célula. Finalmente, presentamos un ensayo basado en microscopía que detecta la formación de estas Pdu MT, lo que permite la investigación de las características moleculares clave que gobiernan la incorporación de PduN en la Pdu MCP. En conjunto, estos resultados representan un paso clave hacia la comprensión de la compleja interacción entre las interacciones de las proteínas de la cubierta, la morfología del compartimento y el rendimiento de la vía encapsulada.

Primero exploramos el impacto de PduN en el ensamblaje in vivo de Pdu MCP utilizando una combinación de microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica de transmisión (TEM) en secciones celulares delgadas de cepas de tipo salvaje (WT, que contienen PduN) y knockout de pduN (ΔPduN). Nuestro ensayo de microscopía de fluorescencia utiliza un indicador de proteína fluorescente verde (GFP) fusionado a un péptido de encapsulación, denominado aquí ssD para la secuencia señal de PduD, que es suficiente para la encapsulación de proteínas heterólogas en Pdu MCP37. Por lo tanto, la distribución del compartimento en toda la célula está indicada por la presencia de la fluorescencia verde asociada con el indicador ssD-GFP encapsulado dentro de la luz de MCP. Como en estudios anteriores, la expresión de Pdu MCP en el fondo de tipo salvaje (que contiene PduN) da como resultado una fluorescencia puntiforme en toda la célula (Fig. 2c), lo que sugiere que los compartimentos bien formados se distribuyen dentro de la célula. Por el contrario, cuando se elimina el gen pduN, la expresión del operón pdu da como resultado líneas de fluorescencia, generalmente alineadas con el eje largo de la célula (Fig. 2c). Estas líneas de fluorescencia indican la formación de estructuras alargadas dentro de la célula capaces de reclutar GFP marcada con ssD. De hecho, la sección celular delgada TEM en células que expresan el operón pdu en la cepa knockout pduN confirma la presencia de estructuras tubulares, en adelante denominadas Pdu MT (Fig. 2c). Curiosamente, tanto la microscopía de fluorescencia como la TEM de sección celular delgada muestran que estas Pdu MT parecen inhibir la división celular, ya que las estructuras atraviesan múltiples surcos de escisión (Fig. 2c, Fig. 1 complementaria). Si bien es sorprendente, estas estructuras alargadas no tienen precedentes en la literatura sobre MCP; también se han observado estructuras extendidas similares en células que expresan carboxosomas deficientes en pentámero, por ejemplo. Sin embargo, se sabe poco sobre la estructura o el contenido de proteínas de estas estructuras tubulares.

a Representación de los diferentes genotipos del operón pdu utilizados en esta figura. b SDS-PAGE teñida con Coomassie de Pdu MT purificadas (ΔPduN) y Pdu MCP (WT) que comparan el contenido de proteína en estas estructuras purificadas, donde las etiquetas indican la proteína Pdu a la que corresponde la banda (es decir, C/G para PduC/PduG), excepto Lys, que indica lisozima. c Comparación de estructuras formadas en cepas formadoras de Pdu MCP (WT) y cepas formadoras de Pdu MT (ΔPduN). Las barras de escala en micrografías ópticas y de fluorescencia son de 5 µm. d Micrografías de contraste de fase y fluorescencia de GFP que muestran el impacto del aumento de la expresión de PduN-FLAG en la formación de estructuras Pdu MT versus estructuras cerradas de Pdu MCP, donde el aumento de la concentración de arabinosa se correlaciona con el aumento de la expresión de la proteína PduN-FLAG del plásmido pBAD33. Las barras de escala en micrografías ópticas y de fluorescencia son de 5 µm. e SDS-PAGE teñida con Coomassie, transferencia Western anti-FLAG y TEM teñida negativamente en Pdu MCP purificadas a partir de una cepa knockout de pduN suplementada con PduN-FLAG de un plásmido. Los datos de origen para (b) y (e) se proporcionan como un archivo de datos de origen. Se observaron resultados similares a los informados en (b – e) en tres réplicas biológicas independientes, excepto para las imágenes TEM de secciones de células delgadas, que se realizaron en múltiples células en una muestra biológica determinada, pero no con réplicas biológicas.

Por lo tanto, intentamos examinar, en detalle, la estructura de las Pdu MT formadas por la expresión del operón pdu en nuestra cepa knockout pduN. Estos Pdu MT se componen de muchas de las mismas proteínas de cubierta que los Pdu MCP, como lo demuestra la presencia de bandas PduA, PduB, PduB ', PduJ y PduU mediante SDS-PAGE en ambas muestras (Fig. 2b). En particular, las bandas asociadas con la carga enzimática (PduCDE, PduG, PduP, PduQ, PduS) también están presentes en la muestra de Pdu MT purificada. El análisis TEM de Pdu MT purificadas (Fig. 2c, Fig. 2 complementaria) muestra que estos tubos tienen un diámetro de 50 ± 10 nm, de acuerdo con los diámetros observados en las secciones celulares. Esta dimensión es distinta del diámetro de 20 nm de las varillas autoensambladas a partir de las proteínas de la cubierta PduA y PduJ solas23,41, lo que indica que alguna combinación de las otras proteínas de la cubierta presentes y la carga encapsulada media el tamaño y la curvatura de estas MT de Pdu41,42. Estos resultados sugieren que las Pdu MT formadas por nuestra cepa knockout pduN son conjuntos complejos de múltiples proteínas, similares a las Pdu MCP.

Al observar que eliminar pduN provocó la formación de Pdu MT en lugar de Pdu MCP, planteamos la hipótesis de que PduN es directamente responsable de mediar en la morfología de los microcompartimentos de Pdu. Para probar esta hipótesis, complementamos nuestra cepa knockout de pduN con un plásmido que contenía PduN etiquetado con FLAG y observamos cambios en las morfologías de los compartimentos en diferentes niveles de inductor utilizando microscopía de fluorescencia (Fig. 2d). Encontramos que el aumento de la expresión de PduN-FLAG disminuye la formación de estructuras alargadas (Pdu MT) y aumenta la observación de fluorescencia puntiforme (Pdu MCP) (Fig. 2d). Curiosamente, incluso sin inductor presente (0% en peso de arabinosa), se observa una disminución en el porcentaje de células con estructuras alargadas (Figura complementaria 3). Es probable que esto sea el resultado de una expresión PduN-FLAG con fugas; Debido a que PduN constituye sólo el 0,6% del contenido total de proteína de la cáscara, no es sorprendente que incluso niveles muy bajos de PduN afecten el cierre de la cáscara43. Validamos estos resultados de microscopía purificando compartimentos de una cepa knockout de pduN suplementada con PduN-FLAG de un plásmido (0,02% en peso de arabinosa). Estos compartimentos exhiben la geometría poliédrica característica de los Pdu MCP por TEM y el patrón de bandas característico de los Pdu MCP bien formados por SDS-PAGE (Fig. 2e). Además, la transferencia Western anti-FLAG en estos mismos compartimentos purificados confirmó la presencia de PduN-FLAG en estas estructuras bien formadas (Fig. 2e). Concluimos que PduN juega un papel directo en la formación de Pdu MCP, probablemente al facilitar la limitación de los vértices de MCP.

A continuación, examinamos los fundamentos moleculares de cómo PduN facilita el cierre de MCP investigando la interfaz de interacción responsable de la incorporación de PduN utilizando simulaciones de dinámica molecular de todos los átomos (AAMD). Trabajos anteriores que modelaron la interfaz entre dos hexámeros de PduA revelaron que los ángulos de interacción preferidos entre los hexámeros desempeñan un papel clave en el ensamblaje de orden superior de estas proteínas44. Presumimos que estudios similares que comparan la interfaz de interacción PduN con la interfaz PduA/PduA podrían arrojar información sobre las características específicas y únicas que permiten a PduN iniciar la limitación de vértices de Pdu MCP. Seleccionamos PduA como socio de interacción para PduN en base a estudios previos que muestran que PduA y PduN interactúan ex vivo21. Construimos un modelo estimado de las interfaces PduA/PduN y PduA/PduA utilizando un enfoque basado en homología que aprovechó la estructura cristalina resuelta del HO MCP (PDB: 5V74). Esta estructura proporciona detalles moleculares exquisitos de cómo las proteínas de cubierta homólogas se ensamblan para formar una cubierta de MCP (ver Métodos para más detalles)15,42. Utilizando este modelo como punto de partida, realizamos simulaciones AAMD de esta interfaz para examinar la energía asociada con varios ángulos de flexión entre PduA y PduN, así como entre PduA y PduA (Fig. 3). Específicamente, calculamos el potencial de fuerza media (PMF) entre cada par de oligómeros de proteínas en función del ángulo de flexión entre los dos componentes (Fig. 3b, e) y la distancia entre sus centros de masa en la dirección y ( Figura 3c). Se pueden encontrar más detalles sobre el cálculo en la Sección de Métodos y en Métodos complementarios. El panorama de energía de flexión resultante de PduA/PduN reveló una fuerte preferencia por un ángulo de flexión de 40° entre PduA y PduN (Fig. 3b) con la energía de flexión (ΔG0°→40° = −6 ± 2 kcal/mol) que comprende más de la mitad de la fuerza de interacción total (ΔGPduN/PduA = −10 ± 2 kcal/mol, Fig. 3c). En particular, esto es mayor que los ángulos de flexión (30°) entre los componentes de hexámero/pentámero reportados en la estructura cristalina de una capa de MCP de Haliangium ochraceum15. Esta preferencia por una interacción doblada es distinta del paisaje de energía de flexión de la interfaz PduA/PduA, que tiene sólo mínimos poco profundos (ΔG0°→34° = −1,2 ± 0,3 kcal/mol) que constituyen menos de una cuarta parte de la PduA total. /PduA energía de interacción (ΔGPduA/PduA = −11 ± 2 kcal/mol44) Observamos dos cosas acerca de este panorama energético de flexión. Primero, que la energía mínima a 34° es consistente con modelos anteriores que investigan las interacciones de flexión PduA/PduA41. En segundo lugar, observamos que existe un segundo mínimo en un ángulo de interacción PduA/PduA de ~70°; sin embargo, dado que este ángulo de flexión no permitiría el ensamblaje de icosaedros o poliedros más grandes como los formados en el sistema Pdu MCP, no creemos que sea físicamente relevante para la discusión aquí. Curiosamente, si bien la preferencia del ángulo de flexión es dramáticamente diferente entre estas dos interfaces, la magnitud de la interacción PduA/PduN y PduA/PduA es similar44 (Fig. 3c). En conjunto, esto sugiere que PduN podría proporcionar un punto de flexión energéticamente favorable que permita el cierre de la carcasa sin requerir una flexión menos favorable de la interfaz PduA/PduA. Dado que esta flexión es intrínseca a la interacción PduA/PduN, incluso los dímeros, trímeros o cualquier otro oligómero que presente PduN también estarían muy curvados. Por lo tanto, su incorporación interrumpiría rápidamente la formación de Pdu MT u hojas planas más pequeñas que probablemente estén presentes al principio del proceso de ensamblaje debido a la baja concentración de PduN.

a Esquema de la interfaz PduA-PduN utilizada para estas simulaciones, donde PduA se muestra en azul y PduN en verde. b Potencial de fuerza media (PMF) calculado a partir de simulaciones AAMD en función del ángulo de flexión, ΘB, entre PduA y PduN. ΔG0°→40° es la diferencia en el PMF entre los ángulos de flexión de 0° y 40°. c PMF calculado a partir de simulaciones AAMD en función de la distancia entre PduA y PduN, utilizado para calcular la energía de interacción total (ΔG) entre estos dos oligómeros. d Esquema de la interfaz PduA-PduA utilizada para estas simulaciones. e PMF calculado a partir de simulaciones AAMD en función del ángulo de flexión, ΘB, entre dos hexámeros de PduA. ΔG0°→34° es la diferencia en el PMF entre los ángulos de flexión de 0° y 34°. Los cálculos utilizados calculan los puntos de datos en (b), (c) y (e) se describen en el Método complementario 1. Las barras de error en los gráficos en (b), (c) y (e) representan el error de muestreo en las energías calculadas. , estimado dividiendo los datos de simulación en diferentes secciones y observando las diferencias en el potencial calculado como se describe en el Método complementario 1, Detalles de cálculo. Los datos de origen para los gráficos (b), (c) y (e) se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Habiendo demostrado que las Pdu MT alargadas se forman en ausencia de PduN, a continuación intentamos investigar la funcionalidad metabólica de estos tubos y cómo la organización en MT frente a MCP afecta el rendimiento de la vía. Presumimos que el cambio morfológico de Pdu MCP a MT puede afectar negativamente el rendimiento de la vía, ya que esperamos que las Pdu MT tengan extremos abiertos que aumentarían el intercambio entre el núcleo enzimático y el citosol.

Exploramos el impacto de la geometría del compartimento en el rendimiento de la vía de Pdu comparando el crecimiento y los perfiles externos del metabolito de Pdu (1,2-propanodiol, propionaldehído, 1-propanol y propionato, Fig. 4a) de cuatro cepas: tipo salvaje (formadoras de MCP). ), ΔPduN (formación de MT), ΔPduA PduJ (control de compartimento roto23) y ΔPocR (sin control de expresión del operón pdu45,46,47). Cultivamos estas cepas en 1,2-propanodiol con exceso de adenosilcobalamina (adoB12), una condición que permite distinguir las condiciones de formación de compartimentos que secuestran con éxito el intermediario tóxico propionaldehído lejos del citosol22,48,49. Los perfiles de crecimiento celular y metabolitos (Fig. 4b, c) muestran que las cepas de control, ΔPocR y ΔPduA PduJ, crecen como se esperaba. Cuando no hay expresión del operón pdu (ΔPocR), no hay crecimiento celular con el tiempo, ya que ninguna de las enzimas capaces de metabolizar el 1,2-propanodiol está presente (Fig. 4b). El seguimiento de metabolitos confirma que no se consume 1,2-propanodiol (Fig. 4c). Cuando se expresa el operón, pero los compartimentos no pueden formarse adecuadamente (ΔPduA PduJ), el crecimiento celular y el consumo de 1,2-propanodiol ocurren inicialmente rápidamente (Fig. 4b, c; tiempo de duplicación de 2.338 ± 0.003 h entre 3 y 9 h), como no existe una barrera proteica de la cáscara que impida el acceso de las enzimas al 1,2-propanodiol. En consecuencia, esta cepa exhibe la generación inicial más rápida de propionaldehído, propionato y 1-propanol (Fig. 4c). Sin embargo, después de aproximadamente 12 h, comienza a ocurrir un retraso en el crecimiento a medida que la acumulación de propionaldehído excede un valor umbral (tiempo de duplicación de 62 ± 18 h entre 12 y 18 h). Esto detiene la absorción de propionato en el metabolismo central, lo que explica tanto el retraso en el crecimiento observado como el retraso en el consumo de propionato en esta cepa entre 12 y 30 h (Fig. 4b). Varios grupos han informado esto en cepas con un fenotipo de compartimento roto19,22,23,49, donde se planteó la hipótesis de que el propionaldehído inhibe la vía del metilcitrato50.

a Esquema de la vía de utilización del 1,2-propanodiol encapsulado en microcompartimentos de Pdu. b Cepas que contienen diferentes geometrías de compartimentos (MCP en Wild Type, líneas azules, MT en ΔPduN, líneas verdes), sin expresión de compartimentos (ΔPocR, líneas grises) y con compartimentos rotos (ΔPduA PduJ, líneas rojas) cultivadas en medios mínimos (NCE ) con 1,2-propanodiol como única fuente de carbono. Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar en tres réplicas biológicas. c Concentración de metabolitos de la vía clave durante el transcurso del crecimiento descrito en (b). Los datos se presentan como valores medios ± desviación estándar en tres réplicas biológicas. Los datos de origen para los paneles (b) y (c) se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Por el contrario, las cepas que contienen Pdu MCP (tipo salvaje) y Pdu MT (ΔPduN) exhiben perfiles de crecimiento consistentes con una vía de Pdu bien encapsulada22. El crecimiento inicial y el consumo de 1,2-propanodiol son ligeramente más lentos que el control del compartimento roto (ΔPduA PduJ), lo que corresponde a tiempos de duplicación de 3,17 ± 0,08 h y 2,64 ± 0,13 para las cepas de tipo salvaje y ΔPduN entre 3 y 9 h, respectivamente. Sin embargo, el crecimiento de las cepas WT y ΔPduN eventualmente supera a la cepa ΔPduA PduJ en momentos posteriores a medida que la acumulación de propionaldehído comienza a afectar el crecimiento, como lo demuestran los tiempos de duplicación de 9,2 ± 1,6 h para la cepa WT y 9,2 ± 1,9 h para la cepa ΔPduN entre 12 y 18 h. Las cepas que contienen Pdu MCP (WT) y Pdu MT (ΔPduN) exhiben una concentración máxima más baja de propionaldehído que la cepa con compartimento roto (ΔPduA PduJ); sin embargo, la acumulación de propionaldehído es ligeramente más rápida en la cepa Pdu MT que en la cepa Pdu MCP, donde hay niveles detectables de propionaldehído a las 9 h de crecimiento (Fig. 4c). Esto sugiere que el cambio en la geometría de MCP a MT altera sutilmente el transporte pasivo de sustrato dentro y fuera del compartimento, afectando la accesibilidad de los sustratos al núcleo enzimático. Esto podría deberse a cambios en la superficie del compartimento o a posibles extremos abiertos de las Pdu MT. Significativamente, en comparación con la cepa Pdu MCP (WT), la cepa Pdu MT (ΔPduN) exhibe concentraciones máximas de propionato más bajas y un consumo más rápido de 1-propanol (Fig. 4c). Esto sugiere que en estas condiciones de crecimiento, la geometría de Pdu MT favorece una absorción más rápida de propionato en el metabolismo central, nuevamente, posiblemente debido a cambios en el transporte promedio de sustrato dentro y fuera de Pdu MT versus Pdu MCP. En conjunto, estos resultados indican que la barrera de difusión proporcionada por la cubierta proteica Pdu MT es suficiente para prevenir la acumulación tóxica de propionaldehído en el citosol.

Al observar que las cepas que contienen Pdu MCP y Pdu MT exhibieron perfiles de metabolitos ligeramente diferentes a lo largo del tiempo, planteamos la hipótesis de que la diferencia clave entre los vehículos de encapsulación en cuestión, MCP y MT, es la relación entre el área de superficie y el volumen de estas estructuras. Para cuestionar esta hipótesis, modificamos un modelo cinético a nivel de sistemas de la vía Pdu36 para tener en cuenta el crecimiento celular y tratar las geometrías MCP y MT. Parametrizamos nuestro modelo utilizando valores de la literatura y luego ajustamos la permeabilidad de MCP y la concentración de PduP/PduQ para que coincidan con las características de la evolución temporal del propionaldehído en medios externos para la cepa de tipo salvaje (consulte la Tabla complementaria 1). Específicamente, la permeabilidad de MCP se ajustó de manera que la escala de tiempo de acumulación y degradación de propionaldehído coincidiera con la observada en los experimentos, y las actividades de PduP/PduQ se ajustaron de manera que el nivel máximo de propionaldehído no excediera los niveles previamente informados que causaban defectos de crecimiento dramáticos (<16 mM). 19. Las MCP de Pdu se modelan como esferas de 140 nm de diámetro con 15 MCP por celda, donde la permeabilidad de la MCP controla el acceso a las enzimas encapsuladas en la MCP (se proporcionan más detalles del modelo en el Método complementario 2). Las escalas de tiempo del consumo extracelular de 1,2-propanodiol y la acumulación de 1-propanodiol/propionato en este modelo Pdu MCP (Fig. 5c) coinciden bien con nuestros datos experimentales (Fig. 4c): el consumo de 1,2-propanodiol ocurre entre 10 y 20 h. , y se observa una acumulación inicial de propionato y 1-propanol a las 10 h. Esto sugiere que la parametrización de nuestro modelo ha capturado correctamente las características clave del comportamiento dinámico de la ruta Pdu. Observamos dos discrepancias entre el modelo y nuestros datos experimentales: (1) el propionato y el 1-propanol eventualmente se consumen en nuestros experimentos, y (2) las concentraciones absolutas de propionaldehído observadas difieren de las predichas en el modelo. Estas diferencias se deben principalmente a la exclusión de las reacciones posteriores del modelo y a la volatilidad y reactividad del propionaldehído en condiciones experimentales, y se analizan en detalle en la Discusión complementaria 1. Dado que las escalas de tiempo de acumulación y consumo de propionaldehído coinciden con nuestro modelo, creemos que nuestro El modelo es lo suficientemente preciso como para permitir la comparación de la acumulación de propionaldehído en diferentes geometrías de compartimentos.

un modelo de MCP esférico, donde R se refiere a una reacción de una enzima determinada y k se refiere a la difusión a través de una barrera (la capa del compartimento o la membrana celular) con una permeabilidad determinada. b Modelo Pdu MT cilíndrico. c Perfiles de metabolitos representativos en medios externos producidos por el modelo para el caso base de MCP esférico (líneas gruesas y ligeramente transparentes) y casos límite de MT cilíndricos (líneas más delgadas y oscuras, sólidas para el caso en el que se supone que el volumen interno de MT es el mismo que volumen total de MCP y línea discontinua para el caso en el que se supone que la superficie total de MT es la misma que la superficie total de MCP). Los datos presentados son perfiles de concentración calculados de manera determinista suponiendo una condición inicial de 1,2-propanodiol 55 mM en medios externos. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego ajustamos nuestro modelo para estudiar cómo el cambio de la geometría del compartimento de esférico (MCP) a cilíndrico (MT) afectaba el rendimiento de la vía. Suponemos que las Pdu MT son cilindros de 50 nm de diámetro y una longitud igual a la longitud de la celda (2,5 µm). Los metabolitos se difunden en MT a través de la superficie a lo largo del eje longitudinal del cilindro, pero no en los extremos (consulte el Método complementario 2 para obtener más detalles sobre el modelado y la Discusión complementaria 1 para una discusión sobre la difusión hacia los extremos del cilindro). Entonces, el último parámetro a establecer en el modelo fue el número de Pdu MT por celda. Para permitir una comparación directa con el caso base de MCP esférico, mantuvimos tantos parámetros como sea posible equivalentes en el modelo MT, incluido el número de enzima. Luego probamos el efecto de las diferencias en la geometría entre los casos Pdu MT y MCP, es decir, un cambio en las relaciones entre el área de superficie y el volumen entre estas dos geometrías. Podríamos mantener constante la superficie total o el volumen encapsulado, pero no ambos. Por lo tanto, consideramos dos casos limitantes: (1) el área de superficie total del compartimento es la misma en los modelos MCP y MT y la concentración de enzima aumenta o (2) el volumen total es el mismo en los modelos MCP y MT y la concentración de enzima es constante. La comparación de estos dos casos limitantes ilustra la diferencia sustancial en el volumen relativo y el área de superficie para cada una de estas geometrías de compartimentos (Fig. 5c). En el caso en que el área de superficie total del compartimento de las MT es la misma que la de las MCP esféricas, pero la concentración de enzima aumenta 1,9 veces, vemos poco o ningún cambio en los perfiles de metabolitos en comparación con el caso de las MCP esféricas (Fig. 5c). Cuando el volumen total del compartimento interno es el mismo en MT y MCP, hay 1,9 veces más superficie para la difusión de metabolitos en MT. Como resultado de esta mayor superficie disponible para la difusión, el 1,2-propanodiol puede difundirse más fácilmente en el MT, donde el PduCDE lo convierte rápidamente en propionaldehído. Esto conduce a un aumento de los niveles máximos de propionaldehído (Fig. 5c).

Los datos experimentales de Pdu MT muestran una acumulación ligeramente más rápida de propionaldehído en la cepa ΔPduN que en la cepa de tipo salvaje, lo que sugiere que el área de superficie general de estas MT puede ser ligeramente mayor que la de las MCP. Esto entra en conflicto con los datos de consumo de 1,2-propanodiol, en los que la cepa ΔPduN consume 1,2-propanodiol más lentamente que la cepa de tipo salvaje, que es la tendencia opuesta observada cuando se aumenta el área de superficie en el modelo. Combinados, esto indica que los cambios geométricos explorados en el modelo no pueden explicar completamente nuestros resultados experimentales; sin embargo, los resultados del modelado describen claramente cómo la geometría del compartimento puede afectar la cinética de la vía encapsulada. Específicamente, estos resultados de modelado sugieren que el área de superficie del compartimento es un parámetro clave para determinar la acumulación de propionaldehído. De hecho, un análisis de sensibilidad local de todos los parámetros utilizados en el modelo revela que el área de superficie total del compartimento es la característica morfológica dominante que controla la acumulación externa de propionaldehído (consulte la Discusión complementaria 1 y las Figuras complementarias 4 y 5 para obtener más detalles).

Estos resultados tienen implicaciones tanto de ingeniería como biológicas. En el ámbito de la ingeniería, sugieren que la forma y la geometría del compartimento ofrecen un mango único para ajustar el rendimiento de la vía encapsulada. Biológicamente, estos resultados indican que la geometría del compartimento puede desempeñar un papel en la eficacia de la retención intermedia tóxica, lo que sugiere una justificación más allá del cierre estricto para la formación de estructuras compartimentales más esféricas.

Habiendo establecido la importancia de la proteína de vértice PduN en el cierre de MCP y el impacto de la geometría del compartimento en el rendimiento de la vía encapsulada, a continuación desarrollamos un ensayo basado en microscopía para detectar la formación de Pdu MT versus Pdu MCP. Este ensayo se basa en la observación de que la formación de Pdu MT in vivo da como resultado un fenotipo celular alargado y vinculado (Fig. 6a).

a Esquema de fenotipos asociados con la formación de Pdu MCP y Pdu MT. b Gráfico de caja y bigotes de la longitud de las células que expresan MCP (WT) formadas correctamente y células que expresan MT (ΔPduN). Las mediciones celulares se realizaron en tres réplicas biológicas, con un total de 171 células WT medidas y 121 células ΔPduN medidas. El valor de p mostrado se calculó mediante una prueba t de dos colas asumiendo varianzas desiguales. El cuadro se extiende desde el primer cuartil al tercer cuartil de los datos, la línea indica la mediana y los bigotes se extienden desde el cuadro 1,5 veces el rango intercuartil. c Porcentaje de células que contenían 3 o más enlaces (definidos como cuerpos celulares divididos por un surco de escisión claro) en cepas formadoras de MCP (WT) y MT (ΔPduN). Las barras representan valores medios del porcentaje de células unidas en tres réplicas biológicas. Las barras de error representan la desviación estándar de tres réplicas biológicas. El valor p mostrado se calculó mediante una prueba t de dos colas asumiendo varianzas desiguales. Los datos de origen para los paneles (b) y (c) se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El análisis de datos de microscopía en células que expresan Pdu MCP y Pdu MT confirma que el fenotipo de célula alargada está específicamente asociado con la formación de Pdu MT. Realizamos microscopía y medimos tanto la longitud como el número de células por cadena de al menos 100 células en tres réplicas biológicas tanto en una cepa formadora de MCP (WT) como en una cepa formadora de MT (ΔPduN). Encontramos que la longitud de la celda es significativamente diferente en las cepas que forman MCP (1,8 ± 0,4 µm, el error es la desviación estándar) y las que forman MT (8 ± 6 µm, el error es la desviación estándar) (p <0,0001) (Fig. 6b) . Además, más del 80% de las células que expresan MT forman cadenas de 3 o más células, mientras que las células que expresan Pdu MCP son siempre células individuales o células dobles que están en proceso de dividirse adecuadamente (Fig. 6c). Por lo tanto, tanto la longitud celular como el porcentaje de células unidas proporcionan una lectura conveniente para distinguir entre cepas que expresan Pdu MCP y Pdu MT. En particular, este fenotipo celular vinculado es similar al observado cuando las proteínas de cubierta autoensambladas PduA y PduJ se sobreexpresan en E. coli23, un fenotipo que ha permitido una evaluación rápida de la propensión al autoensamblaje de mutantes puntuales de estos hexámeros44. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que se podría aprovechar una estrategia similar para detectar la formación de Pdu MT. Es importante destacar que sabemos que los Pdu MCP se forman cuando PduN se incorpora a la carcasa del compartimento, y los Pdu MT se forman cuando PduN no se incorpora a la carcasa del compartimento. En consecuencia, podemos usar este fenotipo relacionado con MT para determinar si las mutaciones puntuales de PduN previenen o permiten la incorporación en la capa del compartimento: las células unidas resultarían de un mutante puntual de PduN que no se incorpora y causa la formación de MT, mientras que las células no unidas resultarían de un mutante puntual de PduN que causa la formación de MT. Mutante puntual que se incorpora correctamente a los MCP.

Ilustramos la utilidad de esta lectura fenotípica para detectar la incorporación de PduN analizando bibliotecas de mutantes puntuales de dos residuos en PduN: una glicina en la posición 52 en PduN (G52) y una treonina en la posición 88 (T88). Nuestra hipótesis es que G52 sería altamente inmutable, ya que está enterrado en la interfaz prevista entre PduN y PduA (Fig. 7a), y se esperaría que la adición de cualquier grupo de cadenas laterales alterara estéricamente la estabilidad de esta interfaz15. Como se esperaba, la mayoría de las mutaciones en este residuo dan como resultado una alta población de células unidas (>60%, Fig. 7b, arriba), lo que indica que estos mutantes puntuales están formando Pdu MT. De hecho, la fluorescencia y la microscopía electrónica confirman que las células que expresan el operón pdu con PduN-G52C contienen estructuras Pdu MT alargadas (Fig. 7c). La prevalencia del fenotipo de células vinculadas, asociado con la formación de MT, en todos los mutantes puntuales de PduN G52 sugiere que estas mutaciones no permiten la incorporación de PduN en la cubierta de MCP y, por lo tanto, muestran que el residuo G52 es altamente inmutable. Curiosamente, un mutante puntual, G52N, en el que la glicina está mutada a asparagina, muestra un porcentaje menor de células unidas que el knockout de PduN (p <0,01, prueba t de dos colas que supone variaciones desiguales). La microscopía de fluorescencia en este punto mutante sugiere que hay una mezcla de estructuras en estas células, como lo demuestra la combinación de puntos fluorescentes y rayas en estas imágenes (Fig. 7c). TEM en secciones de células delgadas y compartimentos purificados confirma este hallazgo, mostrando la presencia de estructuras poliédricas y alargadas (consulte la Discusión complementaria 2 para una discusión detallada). Este resultado sugiere que el grado de elongación celular puede ser semicuantitativo, ya que las células más cortas, pero aún unidas, contienen una población mixta de Pdu MCP y MT.

una estructura de cinta de la interfaz PduA-PduN (tomada de las simulaciones de ángulo de flexión de 40° que se muestran en la Fig. 3), destacando los dos residuos mutados en este trabajo: glicina 52 (G52) en color púrpura, que está enterrada en la interfaz. y treonina 88 (T88) en amarillo, que se encuentra en la parte superior de la interfaz PduA-PduN. b Porcentaje de poblaciones de células vinculadas (definidas como en la Fig. 6) para cepas que expresan el operón pdu con todas las mutaciones puntuales posibles en la posición 52 en PduN (arriba) y en la posición 88 en PduN (abajo). Las barras representan el porcentaje medio de células unidas en tres réplicas biológicas. Las barras de error indican la desviación estándar en porcentaje de células unidas en tres réplicas biológicas. Se contaron al menos 100 células en total para cada mutante puntual. El número específico de células contadas para cada mutante puntual está disponible en la Tabla complementaria 2. Los resaltados verdes indican mutantes puntuales que se seleccionaron para una validación más detallada de la formación de Pdu MCP versus Pdu MT. c Caracterización detallada del compartimento Pdu o estructuras de tubos formados en presencia de diferentes mutantes puntuales de PduN. Las barras de escala en micrografías ópticas y de fluorescencia son de 2 μm. Las flechas en micrografías de secciones de células delgadas indican estructuras ricas en proteínas. El gel SDS-PAGE teñido con Coomassie se marca con las bandas esperadas para diversas proteínas Pdu o lisozima (Lys). Se observaron resultados similares en tres réplicas biológicas independientes para experimentos de microscopía óptica y SDS-PAGE. Las imágenes TEM de estructuras compartimentales purificadas y de secciones celulares delgadas solo se realizaron una vez. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, investigamos la mutabilidad del residuo T88 en PduN, que se encuentra en la parte superior de la interfaz PduA/PduN (Fig. 7a). Nuestra hipótesis es que este residuo sería susceptible de mutación porque no está ubicado en la interfaz pentámero/hexámero (PduN/PduA). Todas las células que expresan compartimentos con mutantes puntuales PduN T88 dieron como resultado poblaciones de células unidas bajas (<30%) (Fig. 7b, abajo). Incluso la mutación a prolina, un aminoácido que normalmente altera la estructura de las proteínas, sólo da como resultado que el 23 ± 1% de la población celular esté unida. Esta combinación de resultados sugiere que las cepas que expresan compartimentos con mutantes puntuales PduN T88 generalmente producen MCP Pdu bien formadas. Por tanto, llegamos a la conclusión de que este residuo T88 en PduN es altamente mutable. Confirmamos la presencia de Pdu MCP bien formados en la cepa ΔPduN :: PduN-T88A utilizando una combinación de microscopía de fluorescencia, TEM y SDS-PAGE (Fig. 7c). Como era de esperar, la microscopía de fluorescencia muestra una fluorescencia puntiforme distribuida a través de la célula, un indicador de MCP bien formadas. TEM en secciones de células delgadas confirma este hallazgo, mostrando estructuras proteicas similares a las encontradas en la cepa de tipo salvaje que expresa Pdu MCP (Figs. 7c, 2c). La TEM en compartimentos purificados a partir de estas cepas confirma la formación de estructuras poliédricas características (Fig. 7c), y la SDS-PAGE teñida con Coomassie en estos mismos compartimentos purificados muestra que el contenido de proteína en estos compartimentos es similar al de los compartimentos purificados a partir de células que contienen un operón pdu de tipo salvaje.

Combinados, estos resultados ilustran la utilidad de este fenotipo celular alargado y vinculado para sondear las interacciones moleculares importantes para el cierre del compartimento. Encontramos que el ensayo distingue fácilmente entre mutantes puntuales PduN que son permisivos y disruptivos para el cierre del compartimento, como lo demuestran las tendencias diferenciales observadas en nuestras bibliotecas de mutantes puntuales G52 y T88. Esperamos que este ensayo basado en microscopía para detectar la funcionalidad de mutantes puntuales de PduN, vinculando la incorporación de PduN a un fenotipo celular vinculado, resulte útil tanto en contextos de ciencia básica como de ingeniería.

Existe un gran interés en reutilizar las MCP para aplicaciones de ingeniería metabólica, donde tienen el potencial de aliviar obstáculos como la cinética de las vías lentas, la acumulación de intermediarios tóxicos y la competencia de cofactores2,11. Si bien se han logrado avances en la carga de carga no nativa en estos sistemas de manera controlada40,51,52,53,54,55,56, faltan los criterios de selección para un sistema MCP en cualquier aplicación de ingeniería determinada. Esto incluye características de MCP como el tamaño y la morfología. Aquí, informamos una caracterización en profundidad de una geometría alternativa del compartimento de Pdu, Pdu MT, que se forma cuando la proteína de vértice PduN no puede incorporarse a la capa de Pdu. Curiosamente, este cambio en la morfología tras la pérdida de proteínas que contienen BMV no es universal en todos los sistemas compartimentales: en ausencia de proteínas de vértice, los β-carboxisomas forman estructuras alargadas similares a las Pdu MT34, pero los α-carboxisomas predominantemente forman icosaedros regulares35. Además, otros metabolosomas pueden formar icosaedros cerrados en ausencia de pentámeros53,54,57,58. Nuestra hipótesis es que esto puede ser una consecuencia de las interacciones moleculares entre las proteínas de la cubierta, específicamente el ángulo de flexión preferido entre estas proteínas de la cubierta. En este frente, anticipamos que las simulaciones de MD pueden proporcionar información clave para comprender las diferencias entre los sistemas de compartimentos.

La comparación del crecimiento y el rendimiento de la vía en células que expresan Pdu MT y Pdu MCP mostró que las Pdu MT previenen la acumulación del intermediario tóxico propionaldehído en la vía nativa de Pdu. Junto con nuestro modelo cinético a nivel de sistemas, este resultado sugiere que las Pdu MT proporcionan una barrera difusiva entre el citosol y el núcleo de la enzima encapsulada. Sin embargo, observamos que el cambio de morfología de MCP esféricos a MT cilíndricos cambia necesariamente la relación entre el área de superficie y el volumen del compartimento. Esperamos que la diferente relación entre superficie y volumen que ofrecen estas estructuras Pdu MT resulte beneficiosa para vías encapsuladas diseñadas con diferentes perfiles cinéticos. El análisis futuro de diferentes vías encapsuladas en diferentes geometrías de compartimentos proporcionará información valiosa a este respecto.

El descubrimiento de un vínculo genotipo-fenotipo para la formación de Pdu MT proporciona un método basado en microscopía para detectar la formación de estas estructuras que no requiere una purificación prolongada ni equipo especializado. En el contexto de la comprensión del ensamblaje de MCP, esto permite una rápida caracterización de la aptitud y mutabilidad de diferentes residuos que interactúan en proteínas de la cubierta como PduN y PduA. Para fines de ingeniería, este ensayo proporciona un método sencillo para detectar si las mutaciones puntuales de PduN permiten la incorporación de PduN en la cubierta de Pdu MCP. Esto podría resultar útil para incorporar mangos reactivos en esta proteína de cubierta, lo cual es particularmente prometedor a la luz de la utilidad potencial de la incorporación de aminoácidos no canónicos en las MCP59,60. Combinado, esto nos acerca un paso más a aprovechar todo el potencial de los MCP como bionanoreactores de ingeniería.

La secuencia que codifica PduN se clonó en un vector original pBAD33t compatible con Golden Gate (origen de replicación p15a, casete de selección de resistencia a cloranfenicol, promotor inducible por arabinosa) utilizando la clonación Golden Gate61. Se añadió una etiqueta C-terminal 6xHistidina o FLAG a la secuencia PduN durante la clonación. Todos los cebadores se enumeran en los Datos complementarios 3 y todos los plásmidos generados se enumeran en los Datos complementarios 2. Toda la clonación se realizó utilizando células Escherichia coli DH10b.

Todos los mutantes puntuales de PduN se generaron primero en la secuencia de PduN clonada en el vector pBAD33t antes mencionado antes de la integración en el genoma de Salmonella (ver a continuación los métodos de recombinación). Los mutantes puntuales de PduN en la glicina 52 (G52) se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio QuikChange con ADN polimerasa KOD Hot Start (Sigma-Aldrich) en una secuencia de PduN. Los mutantes puntuales de PduN en treonina 88 (T88) se generaron utilizando el método del vector de entrada descrito anteriormente62,63. Brevemente, se utilizó el ensamblaje de Gibson para reemplazar los aminoácidos 80-91 en PduN con un gen GFP constitutivamente activo flanqueado por dos sitios BsaI. Luego se ordenaron mutantes puntuales como cebadores de ADN monocatenario flanqueados por sitios de corte BsaI complementarios a los del vector de entrada. La hebra inversa se rellenó mediante PCR con 12 meros dirigidos a los sitios de corte Golden Gate. El ADN bicatenario se purificó utilizando un kit de limpieza de PCR y se utilizó en reacciones de ensamblaje Golden Gate con el vector de entrada. Los clones candidatos se seleccionaron mediante selección verde-blanco. Las secuencias de todos los plásmidos mutantes puntuales generados se confirmaron mediante secuenciación de Sanger (Genewiz).

Todas las cepas utilizadas en este trabajo se enumeran en los Datos complementarios 1. La recombinación se realizó utilizando la recombinación roja λ como se describió anteriormente64. Brevemente, se realizaron modificaciones genéticas reemplazando primero el gen en el locus de interés con un casete que codifica un gen resistente al cloranfenicol (cat) y un gen sensible a la sacarosa (sacB). Este casete de selección cat/sacB se amplificó a partir del genoma TUC0164,65 utilizando cebadores que añadieron homología al locus genómico de interés. La incorporación genómica de este casete se confirmó mediante selección en caldo de lisogenia (LB)-Agar suplementado con 10 µg/ml de cloranfenicol, seguido de pruebas de sensibilidad a la sacarosa en colonias seleccionadas en placas de LB-Agar suplementadas con 6 % (p/p) de sacarosa. A continuación, el casete de selección cat/sacB se reemplazó con el ADN que codifica el gen deseado, utilizando ADN monocatenario para los knockouts o productos de PCR purificados para los genes completos. Los productos de PCR utilizados para la incorporación del mutante puntual PduN en el locus pduN o la incorporación de ssD-GFP en el locus pduD se amplificaron a partir del plásmido respectivo utilizando cebadores que agregaron homología al locus genómico de interés. Se seleccionó el reemplazo del casete de selección cat/sacB con el ADN de interés para usar sensibilidad a la sacarosa. La secuencia de los clones se confirmó mediante secuenciación de Sanger en productos de PCR amplificados a partir del genoma en el locus de interés.

Los crecimientos de S. enterica para todos los experimentos sin curva de crecimiento se realizaron de la siguiente manera. Se inocularon cultivos nocturnos a partir de colonias individuales en 5 ml de formulación LB, Lennox (LB-L) y se cultivaron a 30 °C, 225 rpm durante 24 h. Para los experimentos en los que PduN-FLAG se expresó a partir de un plásmido, los cultivos nocturnos se complementaron con 34 µg/ml de cloranfenicol. Se subcultivaron durante la noche 1:1000 en 5 ml de medio sin carbono esencial (NCE) (fosfato monobásico de potasio 29 mM, fosfato dibásico de potasio 34 mM, hidrogenofosfato de sodio y amonio 17 mM) suplementado con citrato férrico 50 µM, sulfato de magnesio 1 mM, 42 mM. succinato como fuente de carbono y 1,2-propanodiol 55 mM como inductor del operón pdu. Para los experimentos en los que PduN-FLAG se complementó con un plásmido, el medio se complementó con 34 µg/ml de cloranfenicol y la cantidad especificada de arabinosa, ambos agregados en el momento del subcultivo. Las células se cultivaron en un bloque de 24 pocillos durante 16 h a 37 °C, 225 rpm y luego se prepararon para experimentos de imágenes (ver microscopía de fluorescencia/fase y sección de células delgadas TEM a continuación).

La expresión y purificación de MCP se realizó mediante centrifugación diferencial como se describió anteriormente39,66. Brevemente, se iniciaron cultivos durante la noche a partir de una única colonia en 5 ml de LB-L y se cultivaron a 37 °C, 225 rpm. Las noches se suplementaron con 34 µg/ml de cloranfenicol para las cepas en las que PduN-FLAG se expresó a partir de un plásmido. Se subcultivaron durante la noche 1:1000 en 200 ml de NCE (nuevamente, suplementados con citrato férrico, sulfato de magnesio, succinato y 1,2-propanodiol, como se indicó anteriormente) y se cultivaron a 37 °C, 225 rpm hasta que la DO600 alcanzó 1–1,5. Los cultivos de cepas en las que PduN-FLAG se expresó a partir de un plásmido se complementaron con 34 µg/ml de cloranfenicol y 0,02 % (p/p) de arabinosa, ambos añadidos en el momento del subcultivo. Las células se recogieron mediante centrifugación (4500 x g, 5 min) y se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 32 mM, cloruro de potasio (KCl) 200 mM, cloruro de magnesio (MgCl2) 5 mM, 0,6% (v/v) 1. ,2-propanodiol, octiltioglucósido (OTG) al 0,6 % (p/p), β-mercaptoetanol 5 mM, lisozima 0,8 mg/ml (Thermo Fisher Scientific), ADNasa I 0,04 unidades/ml (New England Biolabs, Inc.) pH 7,5 –8,0). Se permitió que las células resuspendidas se lisaran en este tampón incubando a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, el lisado se aclaró mediante dos rondas de centrifugación (12.000 x g, 5 min, 4 °C). Las MCP o MT se separaron del lisado mediante ultracentrifugación en un rotor de cubeta oscilante (21.000 x g, 20 min, 4 °C), se lavaron con tampón (Tris-HCl 32 mM, KCl 200 mM, MgCl2 5 mM, 0,6 % (v/ v) 1,2-propanodiol, 0,6% (p/p) de OTG, pH 7,5–8,0), y luego se centrifugó nuevamente (21.000 × g, 20 min, 4 °C). Luego se resuspendieron los sedimentos de MCP o MT en tampón (Tris-HCl 50 mM, KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, 1,2-propanodiol al 1% (v/v), pH 8,0). Luego se eliminaron los restos celulares restantes en la muestra mediante tres centrifugaciones de 1 minuto a 12.000 × g. Las MCP o MT purificadas se almacenaron a 4 ° C hasta su uso.

El contenido de proteínas de las muestras de MCP o MT purificadas se evaluó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) combinada con tinción con azul de Coomassie o transferencia Western anti-FLAG. La carga de muestras de MCP o MT purificadas se normalizó mediante la concentración de proteína total, determinada mediante ensayo de ácido bicinconínico, de modo que se cargaron 1,5 µg de proteína por carril. Las muestras se diluyeron en tampón Laemmli y se calentaron a 95 °C durante 5 minutos antes de la carga. Las muestras se separaron en minigeles de poliacrilamida Tris-glicina al 15% (p/p) durante 90 minutos a 120 V. La proteína se visualizó tiñendo con Coomassie Brilliant Blue R-250.

Las muestras para transferencia Western se prepararon y separaron mediante SDS-PAGE como se indicó anteriormente. Las muestras se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando un Bio-Rad Transblot SD a 25 V, 150 mA, durante 35 minutos. La membrana se bloqueó en TBS-T (Tris 20 mM, cloruro de sodio (NaCl) 150 mM, Tween 20 al 0,05 % (v/v), pH 7,5)) con leche en polvo al 5 % (p/p) durante 1 h a temperatura ambiente. temperatura. Luego se sondeó la membrana con un anticuerpo primario anti-FLAG de ratón (MilliporeSigma Cat# F3165) diluido 1:6666 en TBS-T con leche en polvo al 1% (p/p) durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana se lavó con TBS-T y luego se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario de peroxidasa de rábano picante anti-ratón de cabra (Invitrogen Cat# 32430) diluido 1:1000 en TBS-T. Finalmente, la membrana se lavó con TBS-T y posteriormente se reveló usando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal™ West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific) y se tomaron imágenes usando un sistema Bio-Rad ChemiDoc XRS+ equipado con el software Bio-Rad Image Lab.

Las células se prepararon para microscopía en portaobjetos de microscopio esmerilados Fisherbrand™ (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-550-343) y se colocaron entre el portaobjetos y un cubreobjetos de 22 × 22 mm y espesor #1,5 (VWR Cat# 16004-302). Los cubreobjetos y portaobjetos de microscopio se limpiaron con etanol antes de su uso. Se tomaron imágenes de las células en un microscopio vertical Nikon Eclipse Ni-U con un objetivo de inmersión en aceite de 100X utilizando una cámara digital Andor Clara. Se utilizó el software NIS Elements (Nikon) para la adquisición de imágenes. Las imágenes de fluorescencia de GFP se adquirieron con un filtro de paso de banda C-FL Endow GFP HYQ. Se utilizó un tiempo de exposición de 200 ms para todas las imágenes de fluorescencia. El brillo y el contraste de las imágenes de un experimento determinado se ajustaron a los mismos valores en ImageJ67. La longitud de las células se cuantificó utilizando la herramienta de línea segmentada en ImageJ67. La identificación de las células vinculadas se realizó como se describió anteriormente23. Brevemente, cualquier cuerpo celular que contenía tres o más cuerpos celulares divididos por un surco de escisión identificable se contaba como vinculado, mientras que los cuerpos celulares que contenían dos o menos células (o uno o menos surcos de escisión) se consideraban no vinculados. Cada cuerpo celular en un conjunto de células unidas se contó como un evento de una sola célula.

Se prepararon muestras de MT o MCP purificadas y se tomaron imágenes utilizando TEM con tinción negativa como se describió anteriormente20. Brevemente, las muestras se fijaron en rejillas de cobre recubiertas con Formvar de malla 400 (EMS Cat# FF400-Cu) usando una solución de glutaraldehído al 2% (v/v) en agua. Las muestras fijadas se lavaron con agua pura MilliQ™ y se tiñeron con una solución de acetato de uranilo al 1 % (p/p). Las rejillas se secaron y almacenaron antes de la obtención de imágenes. Se tomaron imágenes de las cuadrículas utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEOL 1230 equipado con una cámara CCD montada en la parte inferior Gatan 831. Las mediciones del diámetro MT se realizaron utilizando la herramienta de línea segmentada en ImageJ67.

Las células de muestra se fijaron en paraformaldehído al 2 % (v/v) y glutaraldehído de grado EM al 2,5 % (v/v) en un tampón PIPES 0,1 M, pH 7,4 y se procesaron químicamente con tetróxido de osmio, se deshidrataron con etanol y acetona y se infiltraron con EMBed812. resina epoxi dentro de un procesador de muestras automatizado mPrep ASP1000. Las muestras infiltradas se embebieron en moldes de bloques con resina pura y se polimerizaron a 60 °C durante 48 h. Se cortaron secciones ultrafinas de 60 nm de las células incrustadas utilizando un ultramicrotomo Leica UC7 y una cuchilla de diamante DiATOME de 35 grados. Las secciones se recogieron en rejillas ranuradas de Cu con una membrana de formvar/carbono y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo para mejorar el contraste inherente dentro del microscopio electrónico. Las secciones de muestra se cargaron en un STEM cFEG Hitachi HD2300 a 200 kV y se tomaron imágenes con los detectores de contraste de fase TE y de contraste Z HAADF. Los datos de las imágenes se recopilaron con DigiScan, un sistema de recopilación de datos de trama de rayos electrónicos dentro de Gatan Digital Micrograph.

Los ensayos de crecimiento con 1,2-propanodiol como única fuente de carbono se realizaron como se describió anteriormente23,49. Brevemente, se inocularon colonias individuales durante toda la noche en 5 ml de caldo fantástico (TB) sin glicerol (Dot Scientific, Inc.) y se cultivaron durante 15 a 16 h a 37 °C con agitación orbital a 225 rpm. Se subcultivaron durante la noche hasta una DO600 de 0,05 en medio NCE suplementado con citrato férrico 50 µM, sulfato de magnesio 1 mM, adenosilcobalamina 150 nM y 1,2-propanodiol 55 mM. Los cultivos se cultivaron en matraces Erlenmeyer sin deflectores de 250 ml con tapa de aluminio a 37 °C, 225 rpm.

En cada momento, se eliminó una alícuota de 500 µl de cultivo para cuantificar la OD600 y los niveles de metabolitos. La DO600 se midió en un lector de placas multimodo BioTek Synergy HTX y se convirtió a una DO600 equivalente para un camino óptico de 1 cm. Después de nueve horas, las muestras de cultivo de todas las cepas excepto ΔPocR se diluyeron 1:5 en NCE fresco antes de la medición de OD600 para garantizar que las mediciones se realizaran en el rango lineal del instrumento. Las barras de error en las curvas de crecimiento representan la desviación estándar en tres réplicas biológicas.

La muestra de cultivo celular no utilizada para la medición de OD600 se centrifugó a 13.000 xg durante 5 minutos para eliminar las células. El sobrenadante se recogió y se congeló a -20 °C. Antes del análisis por HPLC, las muestras se descongelaron y filtraron (filtros LC Corning™ Costar™ Spin-X). Las muestras filtradas se analizaron en un sistema HPLC Agilent 1260 y se separaron utilizando una columna LC Rezex™ ROA-Organic Acid H+ (8%) (Phenomenex) a 35 °C. La separación fue isocrática, con ácido sulfúrico 5 mM como fase móvil, fluyendo a 0,4 ml/min. Los metabolitos se detectaron utilizando un detector de índice de refracción (RID)19, donde se observaron picos en el espectro RID a los 30 min para 1,2-propanodiol, 33 min para propionato, 39 min para propionaldehído y 46 min para 1-propanol. Las concentraciones de metabolitos se calcularon a partir de las áreas de pico calculadas en el software Agilent ChemLab utilizando estándares de los metabolitos de interés (1,2-propanodiol, propionaldehído, propionato, 1-propanol) a 200, 100, 50, 20 y 5 mM. Las barras de error en las concentraciones de metabolitos informadas representan la desviación estándar de tres réplicas biológicas.

La estructura inicial para el modelo atomístico de la interfaz PduA/PduN se generó de la siguiente manera. La estructura de PduA se tomó de PDB 3NGK25. La estructura de la subunidad PduN se estimó utilizando el portal web Phyre268. Luego se generó la estructura del pentámero alineando cinco copias de esta estructura de subunidad PduN con la estructura BMC-P extraída de PDB 5V7415 usando la herramienta MatchMaker en UCSF Chimera69,70. Luego, esta estructura se minimizó utilizando los parámetros predeterminados en la herramienta Minimizar estructura de UCSF Chimera. Para construir la interfaz PduA/PduN, se extrajo una interfaz BMC-H/BMC-P de PDB 5V74, que es una estructura cristalina resuelta de un microcompartimento completo de Haliangium ochraceum15. Luego se utilizó la herramienta MatchMaker de Chimera para alinear el hexámero PduA y el pentámero PduN con las estructuras BMC-H y BMC-P, respectivamente. Luego, la estructura de la interfaz PduA/PduN se minimizó nuevamente utilizando los parámetros predeterminados en la herramienta Minimizar estructura de Chimera69. La interfaz PduA/PduA se generó de la misma manera, excepto que se utilizó una interfaz BMC-H/BMC-H de la estructura PDB 5V74.

Antes de ejecutar las simulaciones, los modelos PduA/PduA y PduA/PduN se solvataron en agua que contenía NaCl 100 mM. Utilizando el motor de dinámica molecular GROMACS71, el sistema se sometió a un equilibrio de presión y temperatura constantes (NPT) de 100 ps con las cadenas principales de proteínas restringidas. Luego se ejecutaron simulaciones de MD dirigida para crear configuraciones en las que las proteínas adoptan muchos ángulos o distancias de curvatura diferentes (según la naturaleza del cálculo). Para calcular el potencial de flexión, la proteína se vio obligada a moverse solo en dos dimensiones, de modo que solo podía cambiar el ángulo de flexión entre las dos proteínas. Luego se realizó un muestreo de paraguas en la dirección z y se mapeó nuevamente en la dirección θB, convirtiendo las fuerzas en la dirección z en aquellas en la dirección θB como se describe en el Método complementario 1. Para la fuerza de interacción total del paraguas estándar PduA/PduN Se aplica el muestreo. Se proporcionan más detalles para las simulaciones AA MD en el Método complementario 1.

El modelo cinético utilizado para simular la vía Pdu se modificó a partir de trabajos anteriores36 y se describe con todo detalle en el Método complementario 2. Aquí, fuimos más allá del análisis de estado estacionario y analizamos los perfiles de metabolitos a lo largo del tiempo para reflejar las condiciones de crecimiento en nuestros experimentos. . También modelamos explícitamente los medios externos y tomamos en cuenta el aumento en el número de células según los datos de la curva de crecimiento experimental. Calculamos la dinámica de los metabolitos 1,2-propanodiol, propionaldehído, propionil-CoA, 1-propanol y propionato dentro del interior, el citosol y los medios de MCP/MT. Teniendo en cuenta que la difusión de metabolitos con cada región es mucho más rápida que la cinética de la enzima y el transporte a través de la membrana celular o la capa de MT/MCP, asumimos que cada volumen está bien mezclado y no tiene variación espacial. Por tanto, la principal consecuencia de la geometría elegida es la superficie y el volumen de cada región.

Nuestro modelo supone que los MCP son esferas con un diámetro de 140 nm y los MT son cilindros con un diámetro de 50 nm y una longitud igual a la de la celda. Los metabolitos se difunden pasivamente en MCP esféricas sobre toda la superficie esférica a una velocidad determinada por la permeabilidad de la capa. En los MT, los metabolitos solo pueden difundirse en el volumen cilíndrico a lo largo del eje longitudinal del cilindro, y no en los extremos, nuevamente a una velocidad determinada por la permeabilidad de la capa. Un modelo alternativo que considera la difusión desde los extremos de la MT se describe en detalle en el Método complementario 2. Se supone que la permeabilidad de las MCP/MT es la misma para todos los metabolitos. Existe un número determinado de MCP o MT en una celda en todo momento, establecido por el parámetro MCP/MT por celda. Se supone que las células tienen forma de cápsula.

Se supone que todas las enzimas exhiben una cinética de Michaelis Menten. Suponemos que las reacciones catalizadas por PduCDE, PduP y PduQ solo pueden ocurrir dentro del MCP/MT, y que las reacciones catalizadas por PduL y PduW que convierten propionil-CoA en propionato ocurren en un solo paso en el citosol de la célula. La conversión de 1,2-propanodiol en propionaldehído mediante PduCDE se supone irreversible. Las conversiones de propionaldehído en propionil-CoA o 1-propanol mediante PduP y PduQ, respectivamente, se consideran reversibles. La conversión de propionil-CoA en propionato mediante PduL/PduW se supone irreversible.

Este modelo se implementó en Python72 y está disponible en GitHub [https://github.com/cemills/MCP-vs-MT]73. Una descripción detallada de las ecuaciones se encuentra en el Método complementario 2. Los parámetros se resumen en la Tabla complementaria 1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Todas las cepas y plásmidos utilizados en este estudio están disponibles previa solicitud. Utilizamos los PDB 5V7415 y 3NGK25 en este trabajo para generar coordenadas iniciales para las simulaciones de todos los átomos realizadas en este trabajo, como se describe en la sección Métodos. Los datos fuente se proporcionan con este documento.

Los códigos utilizados para el modelado cinético están disponibles en GitHub [https://github.com/cemills/MCP-vs-MT]73.

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Descargar referencias

Los autores agradecen y reconocen a los miembros de los grupos Mangan, Olvera de la Cruz y Tullman-Ercek por sus interesantes debates en torno a este trabajo. Los autores agradecen específicamente al Dr. Chris Jakobson por los plásmidos utilizados en este estudio. Este trabajo fue financiado en parte por la Oficina de Investigación del Ejército (concesión W911NF-19-1-0298 a DTE y MCJ) y el Departamento de Energía (concesión DE-SC0019337 a DTE y NMM y concesión DE-FG02-08ER46539 a MOdlC). NWK fue financiado por el Programa de becas de investigación para graduados de la Fundación Nacional de Ciencias (subvención DGE-1842165) y por la Beca de capacitación de los Institutos Nacionales de Salud (T32GM008449) a través del Programa de capacitación en biotecnología de la Universidad Northwestern. MOdlC agradece el apoyo computacional de la Fundación Sherman Fairchild. Este trabajo utilizó las instalaciones de BioCryo del Centro NUANCE de la Universidad Northwestern, que recibió el apoyo de SHyNE Resource (NSF ECCS-2025633), el IIN y el programa MRSEC de Northwestern (NSF DMR-1720139). Gráficos y análisis moleculares realizados con UCSF Chimera, desarrollado por Resource for Biocomputing, Visualization and Informatics de la Universidad de California, San Francisco, con el apoyo de NIH P41-GM103311.

Departamento de Ingeniería Química y Biológica, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Carolyn E. Mills, Charlotte H. Abrahamson, Michael C. Jewett y Danielle Tullman-Ercek

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Curt Waltmann y Mónica Olvera de la Cruz

Departamento de Ciencias de la Ingeniería y Matemáticas Aplicadas, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Andrew G. Archer, Sasha Shirman y Niall M. Mangan

Programa Interdisciplinario de Ciencias Biológicas, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Nolan W. Kennedy y Niall M. Mangan

Programa de Maestría en Ciencias en Biotecnología, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Alejandro Jackson

Centro Experimental de Caracterización Atómica y a Nanoescala de la Universidad Northwestern, Evanston, Illinois, EE. UU.

Eric W.Roth

Centro de Biología Sintética, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Michael C. Jewett, Niall M. Mangan, Mónica Olvera de la Cruz y Danielle Tullman-Ercek

Departamento de Química, Universidad Northwestern, Evanston, IL, EE. UU.

Monica Olvera de la Cruz

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CEM, CW, NWK, ADJ, MOdlC y DTE concibieron este proyecto. CEM, NWK, CHA, ADJ y EWR realizaron experimentos. CW realizó simulaciones atomísticas. Todos los autores contribuyeron al análisis y la interpretación de los datos. AGA, SS y NMM contribuyeron al desarrollo del software utilizado en el modelo cinético a nivel de sistemas. CEM y DTE escribieron el manuscrito. CEM, CW, AGA, NWK, CHA, ADJ, EWR, SS, MCJ, NMM, MOdlC y DTE revisaron y contribuyeron al manuscrito.

Correspondencia a Danielle Tullman-Ercek.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Jon Marles-Wright y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Mills, CE, Waltmann, C., Archer, AG y col. La proteína Vertex PduN sintoniza el rendimiento de la vía encapsulada al dictar la morfología del metabolosoma bacteriano. Nat Comuna 13, 3746 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31279-3

Descargar cita

Recibido: 12 de noviembre de 2021

Aceptado: 09 de junio de 2022

Publicado: 29 de junio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31279-3

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