Blog

Jun 20, 2023

La base conformacional de las proteínas de la biosíntesis de isoflavonas.

Communications Biology volumen 5, Número de artículo: 1249 (2022) Cite este artículo 1022 Accesos 1 Citas 1 Detalles de Altmetric Metrics Los isoflavonoides desempeñan funciones importantes en la defensa de las plantas y también

Biología de las comunicaciones volumen 5, número de artículo: 1249 (2022) Citar este artículo

1022 Accesos

1 Citas

1 altmétrica

Detalles de métricas

Los isoflavonoides desempeñan un papel importante en la defensa de las plantas y también exhiben una variedad de actividades que promueven la salud de los mamíferos. Su biosíntesis es iniciada por dos enzimas con actividades catalíticas inusuales; 2-hidroxiisoflavanona sintasa (2-HIS), un citocromo P450 unido a una membrana que cataliza una migración e hidroxilación de un anillo arilo acoplado, y 2-hidroxiisoflavanona deshidratasa (2-HID), un miembro de una gran familia de carboxilesterasa que paradójicamente cataliza la deshidratación de 2 -hidroxiisoflavanonas a isoflavonas. Aquí informamos las estructuras cristalinas de 2-HIS de Medicago truncatula y 2-HID de Pueraria lobata. La estructura 2-HIS revela una conformación única del citocromo P450 y un modo de unión de hemo y sustrato que facilita la migración del anillo de arilo acoplado y las reacciones de hidroxilación. La estructura 2-HID revela la arquitectura del sitio activo y los supuestos residuos catalíticos para las actividades duales de deshidratasa y carboxilesterasa. Los estudios de mutagénesis revelaron residuos clave implicados en la unión y la especificidad del sustrato. Comprender la base estructural de la biosíntesis de isoflavonas facilitará la ingeniería de nuevos isoflavonoides bioactivos.

Los isoflavonoides se encuentran principalmente en las legumbres y desempeñan funciones importantes en la defensa de las plantas. También tienen diversas actividades estrogénicas, antiangiogénicas, antioxidantes y anticancerígenas, lo que les hace populares como suplementos dietéticos1,2,3,4. La isoflavona genisteína puede inhibir el crecimiento de células cancerosas mediante la modulación de genes relacionados con el control del ciclo celular, la apoptosis y las vías de señalización celular5,6. Los isoflavonoides se sintetizan a través de la vía central de los fenilpropanoides y la vía de la rama específica de isoflavonoides. La 2-hidroxiisoflavanona sintasa (2-HIS) cataliza la reacción del punto de entrada en la biosíntesis de isoflavonoides para convertir la flavanona en (2R, 3S)-2-hidroxiisoflavanona1,7. Luego, la 2-hidroxiisoflavanona deshidratasa (2-HID) cataliza la deshidratación de las 2-hidroxiisoflavanonas para producir los primeros productos de isoflavonas, daidzeína o genisteína8 (Fig. 1). Los genes 2-HIS se han caracterizado a partir de leguminosas como el regaliz (Glycyrrhiza echinata)9, la soja (Glycine max)10 y la leguminosa modelo Medicago truncatula11. El 2-HID se ha identificado y caracterizado en soja8, regaliz (Glycyrrhiza echinate)8, kudzu (Pueraria lobata)12 y Lotus japonicus13.

2-HIS cataliza la hidroxilación y migración del anillo arilo de flavanonas (p. ej., liquiritigenina y naringenina) para convertirlas en 2-hidroxiisoflavanonas, y 2-HID luego cataliza la deshidratación de 2-hidroxiisoflavanonas para producir los productos finales de isoflavona, por ejemplo, daidzeína o genisteína. .

2-HIS es una enzima del citocromo P450 asociada a la membrana que pertenece a la subfamilia CYP93C. Cataliza una reacción única que implica tanto la migración del anillo arilo del anillo B aromático desde la posición C2 a C3 como una reacción de hidroxilación acoplada que agrega un átomo de oxígeno en la posición C29. El 2-HID se clasifica en una gran familia de carboxilesterasa, pero puede no funcionar para la hidrólisis de ésteres in vivo, aunque se ha demostrado cierta actividad carboxilesterasa débil in vitro para el 2-HID de soja con butirato de p-nitrofenilo8. 2-HID funciona in vivo como deshidratasa para la deshidratación de 2-hidroxiisoflavonas. Las bases moleculares para la migración del anillo arilo y las funciones de hidroxilación del 2-HIS y las funciones de hidrólisis y deshidratación del 2-HID no se comprenden, ni tampoco sus mecanismos catalíticos ni sus especificidades de sustrato.

Una gran cantidad de P450 están presentes en las plantas, muchos de los cuales participan en la biosíntesis de productos naturales14,15 y catalizan la oxidación de diversos sustratos en el metabolismo primario y secundario16. Actualmente, solo hay disponibles unas pocas estructuras cristalinas para esta clase muy grande e importante de enzimas vegetales, incluidas dos P450 óxido de aleno sintasas metabolizadoras de peróxido de clase III17,18, y varias P450 vegetales con solo actividad de hidroxilación, por ejemplo, cinamato 4-hidroxilasa ( CYP73A33) de Sorghum bicolor19, CYP76AH1 de Salvia miltiorrhiza20, y CYP90B1, CYP97A3 y CYP97C1 de Arabidopsis thaliana21,22. Aún no se comprenden los mecanismos de reacciones más complejas mediadas por P450 en plantas, como la migración del anillo arilo.

Aquí informamos las estructuras de 2-HIS de M. truncatula y 2-HID de P. lobata. La estructura cristalina 2-HIS revela nuevos modos de unión de hemo y sustrato en una conformación diferente de todos los P450 con estructuras conocidas y proporciona una base para comprender nuevos mecanismos de reacción y especificidades de sustrato y regio dentro de la superfamilia de plantas P450. La estructura 2-HID revela características diferentes de otras estructuras de deshidratasa conocidas pero similares a las carboxilesterasas. Un estudio estructural comparativo identificó además los supuestos sitios de unión para los sustratos, las arquitecturas del sitio activo y los residuos catalíticos para la actividad deshidratasa y las funciones carboxilesterasa. Los estudios de mutagénesis de ambas enzimas revelaron residuos clave implicados en la unión y la especificidad del sustrato.

La estructura cristalina de M. truncatula 2-HIS se determinó utilizando el método de dispersión anómala de longitudes de onda múltiples con un cristal de enzima sustituido con selenometionina en un grupo espacial P212121. Otra forma cristalina nativa de 2-HIS con un grupo espacial P21 se difractó a una resolución de 2,0 Å y la estructura se determinó mediante el método de reemplazo molecular (Tabla 1). 2-HIS exhibe un pliegue CYP común23 y contiene dos dominios con tres láminas β y trece hélices α (Fig. 2, Figs. complementarias 1, 2). Hay dos moléculas en una unidad asimétrica que forman un dímero (Figura complementaria 3) con interacciones extensas. Las estructuras de dos moléculas en la unidad asimétrica son muy similares entre sí con una desviación cuadrática media (RMSD) de 0,59 Å para 451 átomos de Cα. La estructura general de 2-HIS también es similar a la de otros P450, incluido el P450 2C9 humano con un RMSD de 2,52 Å para 239 átomos de Cα (Figuras complementarias 1, 2).

Las hélices α, las hebras β y los extremos N y C están marcados. Las figuras 1-6 se prepararon con MOLSCRIPT51 y RASTER3D52, o PyMOL53.

El grupo protésico hemo se observó en la estructura de 2-HIS con una densidad electrónica bien definida (Figura 4 complementaria) y está ubicado principalmente entre las hélices I y L con la hélice I en el lado distal y la hélice L en el proximal. lado, rodeado por las hélices C y E y el bucle antes de la hélice C (Fig. 3a-d). La cisteína 449 actúa como quinto ligando del hierro del cofactor hemo. Sin embargo, es sorprendente que la ubicación y orientación del hemo sean bastante diferentes en 2-HIS en comparación con otros P450 (p. ej., P450 2C9 humano). El hemo se mueve, en relación con el del P450 2C924,25 humano, hacia las hélices C y E, con una distancia de ~8 Å entre el hierro hemo en las dos estructuras, y la hélice C también se ha desplazado, en ~7-8 Å. (Figura 3c). En comparación con P450 2C9, el plano del anillo de protoporfirina hemo en 2-HIS está inclinado hacia abajo ~ 50 ° (Fig. 3b). Los dos grupos propionato también giran ~90° hacia el bolsillo de unión del sustrato, una configuración muy diferente de los P450 clásicos, en los que ambos grupos propionato forman una fuerte interacción carga-carga con Arg u otros aminoácidos básicos. En la estructura de 2-HIS, Arg433 y Arg446 están cerca de los anillos de hemopirrol C y D. Esta región es flexible en la estructura de 2-HIS, con diferentes conformaciones en las moléculas A y B en la unidad asimétrica. Arg433 en la molécula B forma una interacción carga-carga con el grupo propionato en el anillo hemo pirrol D, pero Arg433 en la molécula A está relativamente lejos del hemo, lo que indica que la interacción entre Arg433 y el hemo es dinámica. Esta ubicación está cerca del sitio de unión del sustrato como se describe a continuación, y la interacción dinámica y la conformación probablemente sean importantes para la unión y la catálisis del sustrato.

una molécula de hemo y sus interacciones con 2-HIS. b Una comparación de las hélices I de 2-HIS (en cian) y P450 2C9 humano (en gris). c,d Una comparación del bucle de unión al hemo de 2-HIS (en cian) y P450 2C9 humano (en gris). Las estructuras del hemo y los residuos clave involucrados en la unión del hemo se muestran como modelos de bolas y palos y se colorean según el elemento: oxígeno, rojo; nitrógeno, azul; azufre, naranja; hierro, negro para 2-HIS y gris para P450 2C9; y carbono, verde y amarillo para los residuos de 2-HIS y hemo, y gris y gris oscuro para los residuos de P450 2C9 y hemo. Se utilizan los mismos códigos de colores de átomos para otras figuras, excepto aquellas con descripciones específicas. Las líneas discontinuas en la Fig. 2a indican las interacciones entre el hemo y R433 y T438.

Las monooxigenasas P450 clásicas contienen una secuencia distintiva (A/GGxD/ETT/S) en la hélice I26, considerada como un motivo de unión al oxígeno con la glicina conservada (Gly298 en P450 2C9 humano) apuntando al hemo y la treonina conservada (Thr301). en P450 2C9) apuntando al sitio de unión de oxígeno. La secuencia correspondiente se conserva en 2-HIS, aunque Ser308 sustituye a la treonina correspondiente. Sin embargo, la conformación de la hélice I y sus interacciones con el hemo en 2-HIS son diferentes a las de P450 2C9 (Fig. 3c). Dado que el grupo hemo se desplaza hacia el extremo N de la hélice I, Gly305 y Ser308 en 2-HIS están lejos del hierro hemo y del "sitio de unión de oxígeno". Ser308 todavía interactúa con el hemo a una distancia de ~ 3,6 Å a un grupo propionato del anillo pirrol D. Ser308 también apunta al supuesto bolsillo de unión del sustrato y podría interactuar con el sustrato (Fig. 3b).

La hélice I en 2-HIS está totalmente distorsionada en la región media (S303-T306), que está alargada sin un patrón de hélice clásico y, en comparación, también desplaza ~ 2-3 residuos hacia el extremo N-terminal de la hélice I. con P450 2C9 (Fig. 3b). El bucle de unión al hemo, Thr438-P450, está ubicado en la cara proximal del hemo, justo antes de la hélice L (Fig. 3c, d). La conformación de la región N-terminal del bucle de unión al hemo de 2-HIS es bastante diferente de la de otros P450; el bucle es más largo y extendido en el extremo N-terminal con Thr438 formando un enlace de hidrógeno con un grupo propionato del anillo hemopirrol C, acomodando el movimiento hemo de ~8 Å. Las porciones media y N-terminal se extienden hacia el anillo de protoporfirina hemo ya que la rotación de ~90° del hemo con su grupo propionato libera espacio para esta nueva conformación.

En la mayoría de los P450, los sitios de unión de oxígeno y sustrato están en el lado distal del hemo. En la estructura 2-HIS, se observó densidad de electrones en la parte superior del hierro hemo, al que puede acoplarse una molécula de agua. La bolsa de unión de oxígeno es relativamente pequeña y está rodeada por los aminoácidos Ser118, Val119, Val122, Trp128, Phe301, Ala304 y Thr306 (Fig. 3a, b). Este bolsillo también podría unir oxígeno, pero no es lo suficientemente grande como para servir como bolsillo de unión al sustrato. Trp128 y Phe301 podrían ser importantes para controlar el acceso y la unión del oxígeno.

Una característica estructural observada de 2-HIS es un gran bolsillo en el borde del hemo, cerca de sus grupos propionato (Fig. 4), y este es probablemente el bolsillo de unión al sustrato. La ubicación es similar a la de los bolsillos de unión del sustrato en otras estructuras P450 reportadas. Debido al desplazamiento del hemo, la bolsa se vuelve profunda con su parte inferior en el bucle antes de la hélice L (p. ej., Phe437) y cerca de las hélices L (Ala455) y K (Phe363). El fondo de esta bolsa es ~6 Å más profundo que el de otras estructuras P450 conocidas en las que los sustratos se ubican cerca de la superficie del hemo. En la parte superior de la bolsa, la conformación de las regiones de entrada del sustrato también es bastante diferente a la de otras estructuras P450 conocidas (Fig. 5). El bucle BC antes de la hélice C en 2-HIS es aproximadamente once aminoácidos más corto que la región correspondiente de la hélice B´ en P450 2C9 humano. El bucle FG en 2-HIS también es aproximadamente ocho aminoácidos más corto que la región correspondiente en P450 2C5 humano que contiene hélices adicionales F´ y G´. Estas secuencias más cortas en 2-HIS dan como resultado un desplazamiento sustancial de la entrada hacia abajo, ~10 Å, hacia la nueva ubicación del hemo.

La liquiritigenina y el hemo del sustrato se muestran como modelos de bolas y palos con átomos de carbono coloreados en amarillo y átomos de hierro en negro. Algunos residuos de aminoácidos en el bolsillo de unión del sustrato dentro de ~4,5 angstroms del sustrato están etiquetados y se muestran como modelos de bolas y palos con átomos de carbono coloreados en verde.

La conformación se muestra en dos orientaciones diferentes con el plano del anillo de hemo perpendicular al papel y los grupos de propionato de hemo apuntando al frente (a) y con los grupos de propionato de hemo apuntando a la derecha (b). La estructura de 2-HIS se ilustra usando diferentes colores: el bucle BC (naranja), las hélices F y G y el bucle FG (verde), la hélice I y la hebra β1-4 (cian); y el P450 2C9 humano está en gris. El sustrato y el hemo en 2-HIS se muestran como modelos de enlace grueso en amarillo y naranja, respectivamente, y el sustrato y el hemo (modelo de enlace fino) en P450 2C9 humano están en amarillo y azul, respectivamente.

La visualización directa de la unión del sustrato mediante cocristalización de 2-HIS con sustratos y remojo de cristales nativos con sustratos resultó fallida repetidamente. Debido al gran desplazamiento de la región de entrada del sustrato en la estructura 2-HIS, se forma una gran cavidad en la superficie molecular. Curiosamente, la región N-terminal antes de la hélice A y las hebras β1-1 y β1-2 de otra molécula del dímero encajan en esta cavidad (Figura complementaria 3b). Las regiones antes y después de la hélice A y los residuos en β2-2 están unidas al dominio transmembrana N-terminal en Pro35 y probablemente interactúan con la membrana, pero están enterradas en la interfaz del dímero. Esto puede favorecer el empaquetamiento estable de moléculas para facilitar la cristalización, pero también explica la cocristalización fallida con sustratos.

El acoplamiento molecular con liquiritigenina de sustrato mostró que el átomo C3 del sustrato se ajusta cerca de los grupos propionato de hemo. Las interacciones entre el sustrato y la enzima son principalmente hidrofóbicas con muchos residuos hidrofóbicos (es decir, Leu113, Val 119, Phe363, Leu369, Val372, Val397, Phe437, Leu439, ​​Leu440 y Leu497) en el bolsillo de unión (Fig. 4). Phe363 puede formar una fuerte interacción hidrofóbica con el anillo A aromático del sustrato. Otros residuos hidrófobos (p. ej., Leu369, Val372 y Leu439) también pueden formar interacciones de Van der Waals con el sustrato. Sin embargo, también se observan residuos polares en el bolsillo de unión del sustrato, Asn117 podría interactuar con el sustrato a través de un enlace de hidrógeno y Ser308 está cerca tanto del hemo como del sustrato. Un estudio mutacional mostró que S308A no tenía actividad enzimática detectable, lo que indica el papel clave de Ser308 en la catálisis.

Asn117, Asp116, Leu113, Val119, Lys373 y Arg374 están cerca del grupo 4´-OH en el anillo B del sustrato y probablemente controlan la migración del anillo. Se ha informado que el mutante K375T del regaliz 2-HIS (CYP93C2) mostró la única actividad enzimática de producir 3-hidroxiflavanona sin migración del anillo27, y el residuo correspondiente es Lys373 en Medicago 2-HIS. Por lo tanto, Lys373 juega un papel clave en la reacción de migración de arilo, posiblemente al interactuar con el 4´-OH del sustrato. Sin embargo, Lys373 también forma un puente salino con Asp116 en el bucle BC para ayudar a determinar la conformación y ubicación de esta característica estructural clave. La mutación de Lys373 alteraría el puente salino con Asp116 y también la conformación del bucle BC, y aboliría aún más la actividad de migración del anillo 2-HIS.

En un modelo inicial del mecanismo catalítico 2-HIS28, se propuso que el intermediario de oxígeno activado unido al hierro hemo primero extrae el hidrógeno 3β del C3 del sustrato de flavanona. Sin embargo, según la estructura actual de 2-HIS, el sustrato no puede encajar encima del hierro hemo, ya que está ubicado en una bolsa grande en el borde del hemo y cerca de sus grupos propionato. Por lo tanto, el oxígeno unido a hierro en el intermediario de oxígeno activado está demasiado lejos del sustrato para insertarse directamente en el sustrato a través del mecanismo de hidroxilación común propuesto de P450.

De manera similar, el hierro hemo en las estructuras de las peroxidasas, por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante (HRP), tampoco es accesible y sus sustratos interactúan con el borde del hemo δ-meso29. La HRP también funciona como monooxigenasa y el oxígeno se introduce mediante la reacción de un producto peroxidante normal con oxígeno o agua. En la estructura de 2-HIS, el sitio en el lado distal del hierro hemo es perfecto para la unión del dioxígeno. En este “sitio de unión de oxígeno” también se puede formar un radical hidroxilo, un tipo de especie reactiva de oxígeno (ROS) generada por sistemas microsomales P45030,31; entonces 2-HIS posiblemente podría utilizar un mecanismo de transferencia de oxígeno ferril29 para transferir el radical hidroxilo al "sitio de transición del radical hidroxilo" cerca de los grupos propionato hemo bajo Ser308. El intermediario de oxígeno activado puede interactuar con el átomo C3 del sustrato a través de los grupos propionato hemo para extraer el hidrógeno 3β, seguido de la transferencia del radical hidroxilo al átomo C2 del sustrato después de la migración del anillo B de fenilo de C2 a C3 (Figura 6).

a Migración del anillo: el sustrato se une cerca de los grupos propionato hemo (1); el carboxilato de hemo extrae 3β-hidrógeno para desprotonar C3 (2); y el anillo B se mueve de C2 a C3 (3). b Hidroxilación: el dioxígeno se une al hierro hemo en el “sitio de unión de oxígeno”; después de que se genera el radical hidroxilo, se transferiría al “sitio de transición del radical hidroxilo” cerca de los grupos propionato hemo bajo Ser308, y luego finalmente se transferiría del intermediario de oxígeno activado al átomo de C2 después de la migración del anillo B de fenilo desde C2. a C3.

También es posible que el hemo y las regiones proteicas circundantes, como la hélice C, sufran un cambio conformacional y se muevan hacia la bolsa de unión del sustrato cuando 2-HIS se une a la NADPH citocromo P450 reductasa y al sustrato. Sin embargo, la bolsa de unión del sustrato se vuelve demasiado pequeña y poco profunda y el sustrato quedaría expuesto en la superficie de la enzima (Fig. 5) si el cofactor hemo se moviera a la ubicación característica de otras estructuras P450 conocidas. El espectro de diferencia de CO reducido se registró con la proteína 2-HIS y reveló un pico característico a 450 nm (Figura complementaria 5a), y el 2-HIS libre de ligando exhibió un máximo de absorción de Soret en su espectro UV-visible a 417 nm (Figura complementaria 5b), lo que confirma que la proteína 2-HIS estaba en un estado nativo. También se llevaron a cabo ensayos de actividad enzimática con la enzima 2-HIS de cristales disueltos y mostraron que la enzima era catalíticamente activa (Fig. 7), lo que indica que la conformación hemo única en los cristales no es un artefacto causado por la desnaturalización.

La enzima 2-HIS procedía de cristales disueltos y el sustrato liquiritigenina se convirtió en 2,7,4'-trihidroxiisoflavanona que posteriormente se deshidrató en daidzeína. Los paneles correctos son los perfiles HPLC de estándares auténticos liquiritigenina y daidzeína.

En resumen, el acortamiento de los bucles BC y FG en 2-HIS da como resultado una ubicación profunda para la región de entrada del sustrato, y el bolsillo de unión del sustrato se mueve aún más hacia abajo con el cofactor hemo alejado ~8 Å. Junto con las diferencias en la hélice I y las regiones de unión del hemo, estas características estructurales de 2-HIS facilitan la migración del anillo que no es función de ningún otro P450 con estructura conocida.

La estructura cristalina de kudzu 2-HID se determinó con una resolución de 2,4 Å mediante el método de reemplazo molecular (Tabla 2). La estructura de 2-HID tiene un pliegue característico de α/β-hidrolasa, su dominio central consiste en una lámina β central de ocho hebras con tres y cuatro hélices α empaquetadas en cada lado, y su región N-terminal contiene una lámina β trenzada (Fig. 8 y Fig. 6 complementaria). La 2-HID se ha clasificado en una gran familia de carboxilesterasa, aunque es una deshidratasa. La comparación estructural mediante una búsqueda DALI mostró que la estructura 2-HID es más similar a la de la carboxilesterasa vegetal AeCXE1 de Actinidia eriantha32 (Figuras complementarias 6-7). La superposición de la estructura de 2-HID a la de AeCXE1 (PDB 2O7R) reveló una fuerte similitud estructural con una desviación cuadrática media (rmsd) de 2,6 Å para 290 átomos de Cα y una identidad de secuencia del 34% (Figuras complementarias 6-7). . La mayor diferencia entre estas dos enzimas se observó en la región N-terminal que presenta una conformación diferente. La región N-terminal de AeCXE1 tiene solo una lámina β de dos cadenas que gira entre 40 y 60° en comparación con la región correspondiente de 2-HID. Se observaron otras diferencias en una región antes de la hélice α5 (Figura complementaria 8).

Las hélices α, las hebras β y los extremos N y C están marcados.

Aunque se exploró la cocristalización de 2-HID con varios sustratos y análogos, solo se obtuvo una estructura de 2-HID complejada con p-nitrofenol, un producto de la reacción de carboxilesterasa, y se observó una densidad electrónica bien definida para el ligando ( Figura 9a). El ligando está ubicado en un bolsillo (Fig. 9a, b) formado por los bucles β1-β2 (P16-L17) y β3-β4 (L29-S31) en la región N-terminal, hélice α5 (L222-V226), bucle β10-α4 (D269-F271) y hélice α7 (H301-F306), incluidos muchos residuos hidrofóbicos (p. ej., Leu17, Leu29, Ala85, Leu222, Ala223, Val226, Phe203, Phe271 y Phe305). En la parte inferior están Thr168 y Ser169 en la hélice α4 y un motivo rico en glicina, Gly83-Gly84-Ala85, en el bucle β6-α1. En el bolsillo se encuentran varios residuos cargados, incluidos Glu89, Asp269, Glu270 e His301, que pueden desempeñar funciones funcionales clave. La ubicación de este bolsillo es similar a la del bolsillo de unión al sustrato identificado en la estructura de la carboxilesterasa AeCXE132 y también es similar al bolsillo de unión a giberelina (GA) observado en la estructura del receptor de giberelina GID133. En comparación con AeCXE1, el sitio activo y el bolsillo de unión al sustrato de 2-HID son relativamente abiertos y grandes (Figura complementaria 8). En las estructuras de AeCXE1 y GID1, los bucles antes de la hélice α5 son relativamente largos, con cuatro aminoácidos más, cubren la parte superior y forman un lado del bolsillo de unión al sustrato. En la estructura 2-HID, este bucle está alejado del sitio activo; esto podría cambiarse a una conformación cerrada cuando el sustrato se une a la enzima.

un mapa de densidad electrónica de 2Fo-Fc a 1,0 σ para p-nitrofenilo (NPO) y una tríada catalítica, Thr168, Asp269 e His301 para la actividad carboxilesterasa; b Sitio activo de 2-HID acoplado con sustrato 2,7,4´-trihidroxiisoflavanona cerca del ácido catalítico Glu89 y la base catalítica His301. Los residuos clave involucrados en la unión del sustrato se muestran como modelos de unión y se colorean según el elemento: oxígeno, rojo; nitrógeno, azul; y carbono, cian. NPO y 2,7,4'-trihidroxiisoflavanona también se muestran como modelos de enlace con sus átomos de carbono en amarillo.

La región N-terminal también es una porción importante del bolsillo de unión al sustrato. En 2-HID, un extremo de la hoja β de tres cadenas que incluye Pro16, Leu17, Leu29 y Ser31 forma un lado grande del bolsillo de unión del sustrato. En AeCXE1, solo se observaron dos hebras β en la región N-terminal correspondiente y están ubicadas en una orientación diferente (Figura 7 complementaria), con la porción del extremo N-terminal plegándose hacia el sitio activo y haciendo la entrada más pequeña en comparación con la Estructura 2-HID. En GID1, hay dos hélices en el extremo N antes de las dos cadenas β y se extienden para cubrir la entrada del sitio de unión de GA.

El sitio activo de AeCXE1 se identificó en el bolsillo de unión al sustrato con tres residuos de la tríada catalítica Ser169, Asp276 e His306. En la estructura de GID1, la ubicación correspondiente se identificó como el sitio de unión de GA con dos residuos activos de carboxilesterasa conservados, Ser191 y Asp289, con His reemplazado por Val319. Los estudios comparativos estructurales y de secuencia con AeCXE1 mostraron que 2-HID posee dos residuos de tríada catalítica correspondientes, Asp269 e His301, y el Ser catalítico es reemplazado por Thr168. Estos tres residuos también pueden formar la tríada catalítica para la función 2-HID carboxilesterasa. Como se observa en la estructura del complejo de 2-HID con ligando, el p-nitrofenol forma un enlace de hidrógeno con Thr168, que se considera el residuo nucleofílico de AeCXE1. Su mecanismo de hidrólisis de éster sería similar al de AeCXE1 y otras carboxilesterasas, y el hidroxilo nucleofílico de Thr168 en la tríada catalítica actúa como catalizador. Sin embargo, en la estructura 2-HID, el átomo CG2 de Thr168 está cerca de His301 y su átomo OG1 apunta hacia el otro lado y forma un enlace de hidrógeno con p-nitrofenol. La orientación y conformación de His301 en 2-HID también es ligeramente diferente de las de His306 en AeCXE1. Además, Ser169 en 2-HID también está cerca del p-nitrofenol y podría interactuar con el sustrato, mientras que el residuo correspondiente en AeCXE1 es Ala170.

Los mutantes 2-HID D269A, H301A y T168A tenían actividad carboxilesterasa débil o nula en el valerato de p-nitrofenilo, y la actividad del mutante S169A se redujo al 52 % de la de la enzima de tipo salvaje (Tabla 3). De manera similar, los mutantes 2-HID de soja D263N y H295A perdieron la actividad carboxilesterasa, y la actividad de los mutantes T164A y T164S se redujo al 1-3% de la enzima de tipo salvaje8. Estos estudios sugieren que Thr168, Asp269 e His301 pueden formar una tríada catalítica similar a la de AeCXE1, y Ser169 también puede desempeñar un papel en la catálisis de la función carboxilesterasa.

Es probable que His301 actúe como base catalítica para extraer hidrógeno en el C3 del sustrato y desempeñe un papel catalítico similar en el evento de deshidratación. El acoplamiento molecular mostró que Glu89 está cerca del sustrato y su cadena lateral puede interactuar con el hidroxilo C2 del sustrato (Fig. 9b y Fig. complementaria 8). Glu89 está altamente conservado en la familia de enzimas 2-HID, pero Phe97 y Ser127 están presentes en la posición correspondiente en las estructuras de CXE1 y GID1, respectivamente. Este Glu89 en 2-HID puede actuar como un ácido para protonar y extraer el hidroxilo para completar la eliminación de agua del sustrato. Las mutaciones H301A, E89A y E89Q abolieron completamente la actividad de deshidratación, pero E89A y E89Q todavía tenían actividad carboxilesterasa, aproximadamente el 23% y el 50% de la actividad enzimática de tipo salvaje, respectivamente (Tabla 3). Por tanto, tanto His301 como Glu89 desempeñan funciones esenciales para la función deshidratasa, y His301, pero no Glu89, también es esencial para la función carboxilesterasa.

Se han caracterizado dos tipos de 2-HID: la enzima de G. echinata es específica para las 2-hidroxiisoflavanonas 4'-O-metiladas y se denomina HIDM (es decir, tipo metoxi), y la enzima de soja tiene una especificidad más amplia para ambos. Sustratos 4'-hidroxilados y -O-metilados y se denomina HIDH (es decir, tipo hidroxi)8.

La comparación de secuencias y el análisis estructural mostraron que los aminoácidos que forman las bolsas de unión al sustrato están altamente conservados en P. lobata 2-HID, soja HIDH y G. echinata HIDM. Sin embargo, existen algunas diferencias menores en el bolsillo de encuadernación del sustrato. P. lobata 2-HID tiene Ser31, Leu222, Ala302, Phe306, la soja GmHIDH tiene los mismos residuos en las posiciones correspondientes, pero G. echinata GeHIDM tiene Gly34, Ser225, Cys305 y Tyr309.

El acoplamiento molecular mostró que el 4´-hidroxilo de la 2-hidroxiisoflavanona apunta cerca de Ser31 y Phe306 en el único 2-HID de P. lobata (Fig. 9b y Fig. complementaria 8), que es similar a la enzima de la soja y debería tener una especificidad más amplia. para formar las isoflavonas 4´-hidroxiladas y -O-metiladas que se encuentran en este P. lobata34. En GeHIDM, Gly34 se corresponde con Ser31 de P. lobata 2-HID. Un sustrato con un grupo 4´-metoxi encajaría bien en el gran bolsillo de unión del sustrato hidrofóbico GeHIDM.

En resumen, describimos las características estructurales de 2-HIS y 2-HID que juntas catalizan las reacciones de entrada en la vía de los isoflavonoides. 2-HIS posee una estructura actualmente única que explica su realización tanto de migración de anillo como de hidroxilación, y 2-HID posee actividades enzimáticas duales como deshidratasa y carboxilesterasa y utiliza un nuevo mecanismo para la deshidratación de isoflavonas. En combinación con nuestro trabajo previo sobre la caracterización estructural de las dos enzimas posteriores isoflavona reductasa35, vestitona reductasa36, (iso)flavonoides glicosiltransferasas UGT85H237 y UGT78G138, estas estructuras proporcionan una base para la modificación e ingeniería de la vía biosintética de isoflavonoides para la formación de nuevas estructuras de isoflavonas. con bioactividades mejoradas.

M. truncatula 2-HIS con sus anclajes transmembrana N-terminales reemplazados con el polipéptido MAKKTSSGR se clonaron en el vector pCWori+ con una etiqueta de cuatro histidinas en el extremo C-terminal. Las células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el plásmido se cultivaron a 37 ° C en medio LB que contenía ampicilina 100 μg / ml, tiamina 1 mM y ácido δ-aminolevulínico 0,5 mM hasta A600 nm = 0,3–0,5. Los cultivos se indujeron con isopropil 1-tio-β-galactopiranósido (IPTG) 1,0 mM y se cultivaron durante 2 días a 30 °C. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, β-mercaptoetanol 10 mM). Después de la lisis con un homogeneizador EmulsiFlex-C5 (Avestin) y la centrifugación a 12.000 rpm a 4 °C durante 20 minutos, se añadió agarosa Ni2+-NTA al sobrenadante que contenía las proteínas diana. Después de la incubación durante 40 a 60 minutos, la mezcla se transfirió a una columna desechable y se lavó extensamente con tampón de lisis. Las proteínas marcadas con His se eluyeron con tampón de elución (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM, β-mercaptoetanol 10 mM). La proteína se purificó adicionalmente en una columna de filtración en gel Superdex-200 (Amersham Pharmacia Biotech) y se concentró a 5 mg/ml en NaCl 10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, β-mercaptoetanol 5 mM.

Se preparó 2-HIS sustituido con selenometionina (SeMet) expresando la proteína recombinante en células de E. coli B834 (DE3) (Novagen) cultivadas en medio mínimo M9 suplementado con SeMet según el método informado con modificaciones menores39. El procedimiento de expresión y purificación fue similar al procedimiento descrito anteriormente para la proteína nativa.

Se clonó 2-HID de kudzu en el vector pDEST17. El plásmido resultante se transformó en la cepa BL21 (DE3) de E. coli (Novagen). Las células de E. coli se cultivaron a 37 °C en medio LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina hasta A600 nm = 0,6–0,8. Después de la inducción con IPTG 0,25 mM, los cultivos se cultivaron durante la noche a 16 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 rpm durante 30 minutos y se almacenaron a -80 °C hasta la purificación. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, β-mercaptoetanol 20 mM). Después de la lisis con un homogeneizador EmulsiFlex-C5 (Avestin) y la centrifugación a 12.000 rpm a 4 °C durante 20 minutos, se añadió agarosa Ni2+-NTA al sobrenadante que contenía las proteínas diana. Después de la incubación durante 40 a 60 minutos, la mezcla se transfirió a una columna desechable y se lavó exhaustivamente con el tampón de lisis (aproximadamente 50 volúmenes de columna). Las proteínas 2-HID marcadas con His se eluyeron con tampón de elución (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM, β-mercaptoetanol 20 mM). Las proteínas se purificaron adicionalmente con columnas de filtración en gel Resource Q y Superdex-200 (Amersham Pharmacia Biotech) y se concentraron a 20 mg/ml en NaCl 10 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, β-mercaptoetanol 5 mM.

Se construyeron mutantes dirigidos al sitio de 2-HIS y 2-HID utilizando la estrategia QuikChange (Stratagene). Las proteínas mutantes se expresaron y purificaron utilizando los procedimientos para proteínas nativas.

Las actividades de 2-HIS de las enzimas mutantes y de tipo salvaje y los cristales de 2-HIS disueltos se determinaron principalmente según un método informado27,40. Una mezcla de reacción de 300 µl incluía K2HPO4 0,1 M, pH 8,0, sacarosa 0,4 M, glutatión 0,5 mM, NADPH 3 mM, liquiritigenina o naringenina 160 µM y aproximadamente 4 mg de microsomas que contenían NADPH-P450 reductasa ATR1 de Arabidopsis thaliana preparados a partir de células WAT11 de levadura transformadas. con pYeDP60 vector41. La reacción se inició añadiendo 25 µg de proteína o cristales y se extrajo con acetato de etilo después de incubación a 16 °C durante 12 h y tratamiento ácido con HCl al 10 % (v/v) a temperatura ambiente durante 1 h. El extracto se evaporó hasta sequedad al vacío y el análisis por HPLC del producto se llevó a cabo con una columna de fase inversa Waters Spherisorb 5 μ ODS2 C18 (250 x 4,6 mm) en un HPLC Agilent HP1100 equipado con un muestreador automático, una bomba cuaternaria y una matriz de diodos. detector. Tanto la liquiritigenina del sustrato como la daidzeína del producto se verificaron mediante análisis HPLC de estándares auténticos y comparación de espectros de absorción y tiempos de retención.

La actividad deshidratasa de 2-HID se determinó según un método publicado8 con algunas modificaciones. Una mezcla de reacción de 300 µl incluía K2HPO4 0,1 M, pH 8,0, sacarosa 0,4 M, glutatión 0,5 mM, NADPH 3 mM, liquiritigenina 300 µM y aproximadamente 5 mg de microsomas que contenían NADPH-P450 reductasa AtATR1 de A. thaliana preparado a partir de células WAT11 de levadura transformadas con Vector 2-HIS pYeDP60 de M. truncatula. La reacción se terminó mediante extracción con acetato de etilo después de incubación a 30 °C durante 2 h. El extracto se concentró a presión reducida hasta que se secó y los productos de reacción se resuspendieron en tampón de reacción (fosfato 100 mM, pH 8,0) a diversas concentraciones como sustratos 2-HID. La reacción se inició mediante la adición de 0,1 µg de proteínas 2-HID mutantes o de tipo salvaje purificadas y se incubó en un volumen final de 100 µl con el tampón de reacción. La reacción se llevó a cabo a 30 °C durante 30 min y luego se terminó con la adición de 100 µl de metanol. La solución se centrifugó a 14.000 g durante 20 minutos y se inyectaron 100 µl de solución para análisis por HPLC como anteriormente.

La actividad de la 2-HID carboxilesterasa se midió frente al valerato de p-nitrofenilo. Una mezcla de reacción que comprende tampón PBS 50 mM, pH 7,1 y sustrato 1 mM que contiene acetonitrilo al 1 % como disolvente en un volumen final de 100 µl. La reacción se inició añadiendo aproximadamente 40 ng - 10 µg de proteínas mutantes o de tipo salvaje 2-HID. La reacción se llevó a cabo a 40 °C durante 1 hy luego se terminó con la adición de 100 µl de metanol. Después de la centrifugación a 12.000 g durante 20 minutos, el sobrenadante (100 µl) se sometió a análisis por HPLC como anteriormente.

Se cultivaron cristales de 2-HIS a partir de gotas colgantes mediante el método de difusión de vapor. Se mezcló proteína 2-HIS a una concentración de 5 mg/ml con un volumen igual de solución de depósito que contenía (NH4)2SO4 200 mM, tartrato de amonio dibásico 200 mM, imidazol 50 mM, FOS-colina-8 al 1%, 30% ( p/v) PEG3350 y K2HPO4/NaH2PO4 0,1 M (pH 6,8). La mezcla se equilibró sobre la solución del depósito a 20 °C. Se obtuvieron dos formas diferentes de cristales. Los cristales derivados de Se-Met se cultivaron en condiciones similares con un 1% de FOS-colina-8 reemplazado por un 1% de NDSB-221.

Antes de la recopilación de datos, los cristales se enfriaron instantáneamente a -180 °C. Los datos de un cristal de proteína 2-HIS nativo se midieron a 2,0 Å con un detector CCD ADSC Quantum 315 en la línea de luz SBC 19ID de Advanced Photon Source. El cristal 2-HIS pertenecía al grupo espacial P21 (a = 49,8 Å, b = 73,2 Å, c = 148,4, β = 93,3°). Había dos moléculas por unidad cristalográfica asimétrica con un contenido de disolvente del 47,7% y una VM de 2,4 Å3/Da. Se recopiló un conjunto de datos MAD de 3,0 Å de un cristal derivado de SeMet, utilizando dos longitudes de onda, en la línea de luz BL9-2 de Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL) utilizando un detector CCD MAR325. El cristal pertenecía a un grupo espacial diferente P212121 (a = 73,8 Å, b = 96,0 Å, c = 154,6 Å).

Se cultivaron cristales de P. lobata 2-HID a partir de gotas colgantes utilizando el método de difusión de vapor. Se mezclaron dos µl de una solución de proteína de 20 mg/ml con 2 µl de solución de depósito (PEG3350 al 18 %, HEPES 0,1 M, pH 7,5). La mezcla se equilibró sobre la solución del depósito a 20 °C. Los cristales crecieron durante 3 a 5 días hasta alcanzar dimensiones de 0,3 × 0,2 × 0,1 mm. Los cristales se congelaron instantáneamente a -180 °C. Los datos de un cristal de 2-HID se midieron con una resolución de 2,4 Å con una fuente de rayos X convencional (RU-H3R) y un detector de placas de imagen Raxis IV++. El cristal pertenecía al grupo espacial P3121 (a = 101,9 Å, b = 101,9 Å, c = 69,7 Å) con un 42% de contenido de disolvente. Había una molécula en la unidad cristalográfica asimétrica.

Se obtuvieron cristales de 2-HID complejados con p-nitrofenol mediante cocristalización. La proteína 2-HID a una concentración de 20 mg/ml se mezcló con p-nitrofenol y se incubó a 4 °C durante 2 h, luego se realizó la cocristalización utilizando las mismas condiciones identificadas para la enzima de tipo salvaje. Los datos del cristal de 2-HID complejado con p-nitrofenol se midieron a 2,3 Å con un detector CCD ADSC Quantum 315 en la línea de luz SBC 19ID de Advanced Photon Source. El cristal pertenecía al mismo grupo espacial P3121 que el cristal 2-HID nativo.

Todos los conjuntos de datos se indexaron, integraron y ampliaron utilizando el paquete de software HKL200042.

La estructura de 2-HIS se determinó utilizando el método de dispersión anómala de longitudes de onda múltiples (MAD). Los datos MAD (40-3,0 Å) de un cristal en el grupo espacial P21 se analizaron con Auto-Rickshaw43, arrojando una cifra de mérito general de 0,44, y se construyó automáticamente un modelo inicial. Este modelo se usó como plantilla para determinar la estructura nativa de 2-HIS en el grupo espacial P212121 usando el método de reemplazo molecular con el programa PHASER44. La construcción de modelos interactivos y el refinamiento cristalográfico se llevaron a cabo utilizando los programas COOT45, CNS46 y Phenix Refine47, respectivamente. Se aplicó una corrección de disolvente en masa. Los factores B se refinaron individualmente para obtener la estructura de la proteína nativa a 2,0 Å. Se agregaron moléculas de agua con Arp/wArp48 y se verificó manualmente su inclusión. En los modelos, los primeros seis (en la molécula A) o siete (en la molécula B) residuos de aminoácidos en el extremo N y los últimos nueve residuos en el extremo C no se observaron en las moléculas A y B, y varias regiones (A97 -107, A284-A288, A422-430, A435-437, B95-107, B227-229, B284-287 y B421-B430) estaban desordenados.

La estructura de P. lobata 2-HID se resolvió mediante reemplazo molecular utilizando el programa PHASER44 y una estructura de carboxilesterasa vegetal AeCXE1 (PDB ID: 2O7R) como modelo de búsqueda. La construcción de modelos interactivos y el refinamiento cristalográfico se llevaron a cabo utilizando los programas COOT45, CNS46 y Phenix47, respectivamente. Se aplicó una corrección de disolvente en masa. Los factores B se refinaron individualmente. Se agregaron moléculas de agua con Arp/wArp y se verificó manualmente su inclusión. No se observaron los primeros ocho residuos de aminoácidos en el extremo N.

Para comprobar el modelo se utilizó el programa PROCHECK49. Todos los ángulos de torsión ϕ-ψ de la columna vertebral están dentro de las regiones permitidas del gráfico de Ramachandran.

Se utilizó el programa de acoplamiento automatizado GOLD50 para acoplar el sustrato en los sitios activos 2-HIS y 2-HID. Se utilizaron parámetros de algoritmo genético predeterminados para controlar la operación del proceso de acoplamiento. Todos los cálculos de acoplamiento se restringieron al bolsillo de unión previsto definiendo el sitio activo con el cofactor hemo (para 2-HIS) o el residuo His301 (para 2-HID). Para 2-HID, se utilizó como referencia la ubicación del ligando en la estructura unida con p-nitrofenol. GOLDscore se utilizó para identificar los resultados de acoplamiento con menor energía. Se analizaron los enlaces de hidrógeno y los contactos de Van der Waals entre ligandos y enzimas para identificar el modo de unión óptimo. Se realizaron ajustes manuales menores de la solución GOLD utilizando el programa COOT.

Los ensayos enzimáticos 2-HID se realizaron por triplicado y los datos de actividad se presentan como media ± error estándar de la media. Los experimentos de purificación de proteínas tanto para 2-HIS como para 2-HID se repitieron tres veces, lo que presentó características de muestra casi idénticas. Para las estructuras reportadas en el artículo, se recolectaron conjuntos de datos de difracción de rayos X con 2 a 5 cristales, y se utilizaron los mejores conjuntos de datos con alta calidad de difracción para la determinación y el refinamiento estructural. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en las Tablas 1 y 2.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas y los factores de estructura para la estructura cristalina informada se han depositado en el Protein Data Bank con los códigos de acceso 8E83 para 2-HIS y 8EA1 y 8EA2 para 2-HID.

Dixon, RA Isoflavonoides: bioquímica, biología molecular y funciones biológicas. en Química Integral de Productos Naturales (ed. Sankawa, U.) 773–823 (Elsevier, 1999).

Dixon, RA & Ferreira, D. Moléculas de interés: genisteína. Fitoquímica 60, 205–211 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dixon, RA y Sumner, LW Productos naturales de legumbres: comprensión y manipulación de vías complejas para la salud humana y animal. Fisiol vegetal. 131, 878–885 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palevitz, BA La soja llega a la calle principal. Científico 14, 8–9 (2000).

Google Académico

Banerjee, S., Li, Y., Wang, Z. y Sarkar, FH Terapia multidireccional del cáncer mediante genisteína. Cáncer Lett. 269, 226–242 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarkar, FH & Li, Y. El papel de las isoflavonas en la quimioprevención del cáncer. Biosci frontal. 9, 2714–2724 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dixon, RA & Steele, CL Flavonoides e isoflavonoides: una mina de oro para la ingeniería metabólica. Tendencias de ciencia vegetal. 4, 394–400 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Akashi, T., Aoki, T. & Ayabe, S. Caracterización molecular y bioquímica de la 2-hidroxiisoflavanona deshidratasa. Participación de proteínas similares a carboxilesterasa en la biosíntesis de isoflavonas de leguminosas. Fisiol vegetal. 137, 882–891 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Akashi, T., Aoki, T. y Ayabe, S. Clonación y expresión funcional de un ADNc del citocromo P450 que codifica la 2-hidroxiisoflavanona sintasa implicada en la biosíntesis del esqueleto de isoflavonoides en el regaliz. Fisiol vegetal. 121, 821–828 (1999).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Steele, CL, Gijzen, M., Qutob, D. y Dixon, RA Caracterización molecular de la enzima que cataliza la reacción de migración de arilo de la biosíntesis de isoflavonoides en la soja. Arco. Bioquímica. Biofísica. 367, 146-150 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Deavours, BE & Dixon, RA Ingeniería metabólica de la biosíntesis de isoflavonoides en alfalfa (Medicago sativa L.). Fisiol vegetal. 138, 2245–2259 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hakamatsuka, T., Mori, K., Ishida, S., Ebizuka, Y. y Sankawa, U. Purificación de 2-hidroxiisoflavanona deshidratasa de cultivos celulares de Pueraria lobata. Fitoquímica 49, 497–505 (1998).

Artículo CAS Google Scholar

Shimamura, M. y col. La 2-hidroxiisoflavanona deshidratasa es un determinante crítico de la productividad de isoflavonas en cultivos de raíces peludas de Lotus japonicus. Fisiol de células vegetales. 48, 1652-1657 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Bolwell, GP, Bozak, K. y Zimmerlin, A. Citocromo P450 vegetal. Fitoquímica 37, 1491-1506 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Schuler, MA y Werck-Reichhart, D. Genómica funcional de P450. Annu Rev. Planta Biol. 54, 629–667 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mizutani, M. & Ohta, D. Diversificación de genes P450 durante la evolución de las plantas terrestres. Annu Rev. Planta Biol. 61, 291–315 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Li, L., Chang, Z., Pan, Z., Fu, ZQ y Wang, X. Modos de unión del hemo y acceso al sustrato para el citocromo P450 CYP74A revelados por estructuras cristalinas de óxido de aleno sintasa. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. 105, 13883–13888 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, DS, Nioche, P., Hamberg, M. y Raman, CS Conocimientos estructurales sobre las rutas evolutivas de las enzimas biosintéticas de oxilipina. Naturaleza 455, 363–368 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhang, B. y col. Estructura y función de la cinamato 4-hidroxilasa del citocromo P450 monooxigenasa de Sorghum bicolor. Fisiol vegetal. 183, 957–973 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu, M. y col. Estructura cristalina de CYP76AH1 en estado unido a 4-PI de Salvia miltiorrhiza. Bioquímica Biofísica. Res Común. 511, 813–819 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fujiyama, K. y col. Conocimientos estructurales sobre un paso clave de la biosíntesis de brasinoesteroides y su inhibición. Nat. Plantas. 5, 589–594 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Niu, G. y col. Base estructural para la biosíntesis de luteína vegetal a partir de α-caroteno. Proc. Acad. Nacional. Ciencia 117, 14150–14157 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Johnson, EF y Stout, CD Diversidad estructural de los citocromos P450 de la membrana eucariótica. J. Biol. Química. 288, 17082-17090 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williams, PA y cols. Estructura cristalina del citocromo P450 2C9 humano con warfarina unida. Naturaleza 424, 464–468 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wester, MR y cols. La estructura del citocromo P450 2C9 humano forma complejo con flurbiprofeno a una resolución de 2,0 A. J. Biol. Química. 279, 35630–35637 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Werck-Reichhart, D. & Feyereisen, R. Citocromos P450: una historia de éxito. Genoma Biol. 1, 1–9 (2000). reseñas3003.

Artículo de Google Scholar

Sawada, Y., Kinoshita, K., Akashi, T., Aoki, T. y Ayabe, S. Residuos de aminoácidos clave necesarios para la migración de arilo catalizada por la 2-hidroxiisoflavanona sintasa del citocromo P450. Planta J. 31, 555–564 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hashim, MF, Hakamatsuka, T., Ebizuka, Y. y Sankawa, U. Mecanismo de reacción del reordenamiento oxidativo de flavanona en la biosíntesis de isoflavonas. FEBS Lett. 271, 219–222 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ortiz de Montellano, PRR Sitios catalíticos de hemoproteínas peroxidasas. Annu Rev. Pharm. Toxico. 32, 89-107 (1992).

Artículo CAS Google Scholar

Yasui, H., Hayashi, S. y Sakurai, H. Posible participación de especies de oxígeno singlete como oxidantes múltiples en reacciones catalíticas de P450. Metab. de fármacos. Farmacocineta. 20, 1-13 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ortiz de Montellano, PR Hidroxilación de hidrocarburos por enzimas del citocromo P450. Química. Rev. 110, 932–948 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ileperuma Marshall, SD y cols. Estructura cristalina de alta resolución de la carboxilesterasa vegetal AeCXE1, de Actinidia eriantha, y su complejo con un inhibidor de alta afinidad paraoxon. Bioquímica 46, 1851–1859 (2007).

Artículo PubMed Google Scholar

Shimada Ueguchi-Tanaka, M. et al. A. Base estructural para el reconocimiento de giberelina por su receptor GID1. Naturaleza 456, 520–523.

Artículo PubMed Google Scholar

Adolfo, LM, Rao, X., Alvarez-Hernandez, A. & Dixon, RA Evaluación de vías hacia la puerarina C-glicosil isoflavona en raíces de kudzu (Pueraria lobata). Planta Directa.6 6, 442 (2022).

Google Académico

Wang, X. y col. Estructura cristalina de la isoflavona reductasa de Alfalfa (Medicago sativa L.). J. Mol. Biol. 358, 1341-1352 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Shao, H., Dixon, RA y Wang, X. Estructura cristalina de vestitona reductasa de alfalfa (Medicago sativa L.). J. Mol. Biol. 369, 265–276 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Li, L. y col. Estructura cristalina de Medicago truncatula UGT85H2: conocimientos sobre la base estructural de una (iso) flavonoide glicosiltransferasa multifuncional. J. Mol. Biol. 370, 951–963 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Modolo, LV, Li, L., Dixon, RA y Wang, X. Las estructuras cristalinas de la glicosiltransferasa UGT78G1 revelan la base molecular para la glicosilación y desglicosilación de (iso)flavonoides. J. Mol. Biol. 392, 1292-1302 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Doublie, S. Preparación de proteínas selenometionilo para la determinación de fases. Métodos Enzimáticos. 276, 523–530 (1997).

Artículo CAS Google Scholar

Tian, ​​L. & Dixon, RA Una enzima bifuncional artificial para la ingeniería del metabolismo de las isoflavonas en plantas no leguminosas. Planta 224, 496–507 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pompon, D., Louerat, B., Bronine, A. & Urban, P. Expresión de levadura de P450 animales y vegetales en entornos redox optimizados. Metanfetamina. Enzima. 272, 51–64 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Otwinowski, Z. & Minor, W. Procesamiento de datos de difracción de rayos X recopilados en modo de oscilación. en Métodos Enzimol. (eds. Carter, CW y Sweet, RM) 276, 307–326 (Academic Press, 1997).

Panjikar, S., Parthasarathy, V., Lamzin, V., Weiss, M. y Tucker, P. Auto-rickshaw: una plataforma automatizada de determinación de la estructura cristalina como herramienta eficaz para la validación de un experimento de difracción de rayos X. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 449–457 (2005).

Artículo PubMed Google Scholar

Read, RJ Ampliando los límites del reemplazo molecular con la máxima probabilidad. Acta Crystallogr. D. Biol. Cristalogr. 57, 1373-1382 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Emsley, P. y Cowtan, K. Coot: herramientas de construcción de modelos para gráficos moleculares. Acta Crystallogr. D. 60, 2126–2132 (2004).

Artículo PubMed Google Scholar

Brünger, AT et al. Sistema de cristalografía y RMN: un nuevo paquete de software para la determinación de estructuras macromoleculares. Acta Crystallogr. D. Biol. Cristalogr. D. 54, 905–921 (1998).

Artículo de Google Scholar

Adams, PD y cols. PHENIX: un sistema integral basado en Python para la solución de estructuras macromoleculares. Acta Cristal. D66, 213–221 (2010).

Google Académico

Lamzin, VS, Perrakis, A. & Wilson, KS La suite ARP/WARP para la construcción automatizada y el refinamiento de modelos de proteínas. en Int. Tablas de cristalografía: cristalografía de macromoléculas biológicas (eds. Rossmann, M. y Arnold, E.) F, 720–722 (Kluwer Academic Publishers, 2001).

Laskowski, RA, MacArthur, MW, Moss, DS y Thornton, JM PROCHECK: un programa para comprobar la calidad estereoquímica de las estructuras de las proteínas. J. Aplica. Cristalogr. 26, 283–291 (1993).

Artículo CAS Google Scholar

Jones, G., Willett, P., Glen, RC, Leach, AR y Taylor, R. Desarrollo y validación de un algoritmo genético para acoplamiento flexible. J. Mol. Biol. 267, 727–748 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kraulis, PJ MOLSCRIPT: un programa para producir gráficos detallados y esquemáticos de estructuras de proteínas. J. Aplica. Cristalogr. 24, 946–950 (1991).

Artículo de Google Scholar

Merritt EA & Bacon, DJ Raster3D: gráficos moleculares fotorrealistas. En Methods in Enzymology (ed. Carter CW y Sweet, RM) 277, 505–524 (Academic Press, 1997).

DeLano, WL Manual del usuario de PyMOL. (DeLano científico, 2002).

Descargar referencias

Agradecemos al Dr. L. Pedersen (NIEHS, NIH) por proporcionarnos amablemente el vector pCWori+, al Dr. FW Dahlquist por su permiso para usar pCWori+, a Jack W. Blount y Varaidzo H. Makina por su ayuda en el cultivo de células de levadura y la purificación de proteínas, y a los científicos del personal. en el Laboratorio de Radiación Sincrotrón de Stanford y en la línea de luz 19ID del Centro de Biología Estructural en la Fuente Avanzada de Fotones, Laboratorio Nacional Argonne (Argonne, IL), para obtener ayuda con la recopilación de datos. Argonne es operado por UChicago Argonne, LLC, para la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental del Departamento de Energía de EE. UU. bajo el contrato DE-AC02-06CH11357. Este trabajo fue apoyado por el Noble Research Institute, Conagen LLC (New Bedford, MA) y la Universidad del Norte de Texas.

Estos autores contribuyeron igualmente: Xiaoqiang Wang, Haiyun Pan.

Instituto BioDiscovery y Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad del Norte de Texas, Denton, TX, 76203-5017, EE. UU.

Xiaoqiang Wang, Vincent Paris, Chunliu Zhuo y Richard A. Dixon

Conagen, Inc., Bedford, MA, 01730, EE. UU.

Haiyun Pan

Departamento de Genética y Biotecnología, Universidad de Osmania, Hyderabad, 500007, India

Someswar Sagurthi

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

Investigación diseñada por XW y RAD. HP, XW, SS, VP y CZ realizaron investigaciones. HP, XW y SS analizaron los datos, y HP, XW y RAD escribieron el artículo.

Correspondencia a Xiaoqiang Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales: Ingrid Span y Luke R. Grinham.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Wang, X., Pan, H., Sagurthi, S. et al. La base conformacional de las proteínas de la biosíntesis de isoflavonas. Común Biol 5, 1249 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04222-x

Descargar cita

Recibido: 26 de mayo de 2022

Aceptado: 03 de noviembre de 2022

Publicado: 15 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04222-x

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.